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norteNuevas herramientas de edición de genes podrían cambiar las reglas del juego de la terapia génica, pero los científicos necesitan desarrollar nuevos enfoques que limiten las mutaciones indeseables. Las repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente espaciadas (CRISPR) -El sistema Cas9 es una de esas herramientas de edición propensas a errores que los científicos modificaron posteriormente para limitar su carga mutacional.1 Sin embargo, no está claro cómo las técnicas adaptadas, llamadas edición base y principalcompárelo con el sistema CRISPR-Cas9 original.2 Reportaje en la revista Naturaleza Biotecnologíainvestigadores del Instituto Científico San Raffaele revelaron que edición base y principal produjo más mutaciones de las sugeridas anteriormente, pero las produjo con menos frecuencia que CRISPR-Cas9.3

La edición del gen CRISPR-Cas9 se basa en un ARN guía que se une a una secuencia de ADN deseada y una enzima Cas9 que corta ambas hebras de ADN en ese sitio, creando una rotura de doble hebra. Los científicos editan las secuencias en los extremos cortados antes de utilizar diferentes enfoques para guiar la reparación. Sin embargo, a menudo hay secuencias de ADN adicionales con extremos romos en el núcleo que podrían mezclarse accidentalmente con los extremos cortados durante la reparación, lo que provocaría mutaciones. Por lo tanto, los investigadores adaptaron las técnicas CRISPR-Cas9 para cortar una base de una hebra mientras dejaban intacta la hebra complementaria, evitando así la unión aleatoria de extremos romos y cortados que conducen a mutaciones.2

Luigi Naldiniinvestigador de terapia génica y coautor del estudio, ha realizado análisis costo-beneficio de herramientas de edición de genes a lo largo de su carrera.4,5 Dijo: “Para nosotros era obvio que [should] Investigar de manera similar si la edición básica realmente proporcionó un beneficio sobre la tecnología de edición anterior”. Planteó la hipótesis de que cuando la hebra mellada se separa de la hebra complementaria intacta durante la replicación, podría servir como plantilla para formar una segunda hebra mellada. Esto crearía una doble hélice de ADN con un extremo romo que podría unirse aleatoriamente con otro extremo romo, volviendo así al ADN vulnerable a las mutaciones.

Ver también «Una alternativa CRISPR para corregir mutaciones que sensibilizan las células al daño del ADN«

Para descubrir si los editores básicos eran realmente menos propensos a errores que las herramientas CRISPR-Cas9, el equipo comparó su rendimiento en la edición de ADN. Eligieron apuntar al gen de la β2-microglobulina porque codifica una proteína de la superficie celular que es fácil de detectar y cuantificar con anticuerpos. Utilizando ambas tecnologías, modificaron el gen en las células madre hematopoyéticas (HSC), un objetivo común de la terapia genética para trastornos de la sangre.6 Ambas herramientas eliminaron el gen con una eficiencia comparativamente alta (aproximadamente del 80 al 90 por ciento), pero los editores de bases produjeron muchas menos mutaciones no deseadas que la herramienta CRISPR-Cas9. Como sospechaba Naldini, el equipo detectó mutaciones que surgen de roturas de doble hebra en células editadas con bases, aunque a un nivel más bajo que en las células editadas con CRISPR-Cas9. Estas mutaciones ocurrieron en el sitio mellado, lo que sugiere que se transformó en una rotura accidental de la doble cadena durante la replicación. «Es un error decir que esta tecnología no tiene roturas», afirmó Naldini.

El equipo también exploró si los sistemas de edición desencadenaban respuestas celulares no deseadas. La herramienta CRISPR-Cas9 pareció activar una vía de reparación del ADN gobernada por p53, una proteína conocida como «guardián del genoma.”7 Esto era de esperarse para una herramienta de edición que genera deliberadamente roturas de doble cadena; sin embargo, también detectaron activación de p53 a un nivel reducido para un editor de base específico que convierte la citosina en timina.

CRISPR-Cas9 superó a los editores básicos en un aspecto: no desencadenó la inmunidad innata. Los editores de base utilizan ARN guía largos que la célula considera extraños, lo que desencadena Respuestas inmunes.8

Estas respuestas causan preocupación porque el rendimiento de las HSC editadas producidas para terapia génica nunca es del 100 por ciento. Con el tiempo, las células editadas pueden morir si son superadas en número por las no editadas y libres de respuestas al estrés, lo que reduce la durabilidad de la terapia. «Probablemente se trate de una selección negativa de aquellas células que experimentaron tal vez la mayor carga de respuestas y resultados perjudiciales», sugirió Samuele Ferraribiotecnólogo y coautor del estudio.

«Probablemente el mensaje principal sea la seguridad de la nueva tecnología», dijo Annarita Miccio, biólogo molecular del Institut Imagine que no participó en el trabajo. Su colega Mégane Brussonque tampoco participó en el estudio, añadió: «Es cierto que hay menos riesgos genotóxicos con los editores base y los editores principales, pero como muestran en este artículo, todavía existe cierta preocupación que debemos tener en cuenta cuando Desarrollar terapia génica o estrategias de edición del genoma para enfoques terapéuticos”.

Afortunadamente, los investigadores encontraron una manera de reducir la mayoría de los efectos genotóxicos de los editores de bases a un nivel indetectable optimizando primero los ARN guía y luego reduciendo la dosis utilizada. Para prolongar la vida útil del ARN, agregaron características como una tapa de 5 primas que evitan su descomposición en la célula.9 Sin embargo, la optimización no eliminó por completo todos los efectos no deseados. Los editores de bases todavía desencadenaron mutaciones en sitios aleatorios del genoma más allá del sitio objetivo.

Por último, el equipo exploró la edición principal, la otra técnica de mellado. En lugar de modificar un único par de bases, elimina varias bases de una hebra de un gen e inserta otras nuevas en su lugar.2 «Ésta es la última novedad entre todas las herramientas de edición», dijo Ferrari, y añadió que, debido a su infancia, «la edición principal aún no se ha probado en entornos clínicos».

Ver también «La edición principal alcanza la mayoría de edad«

De manera similar a la edición de bases, la edición principal provocó mutaciones en el sitio de la mella que significaron la formación accidental de roturas de doble hebra y desencadenaron la vía de reparación del ADN de p53 más la señalización inmune. Al igual que con la edición básica, será necesario optimizar la herramienta para evitar estas respuestas celulares no deseadas.

La edición básica y principal también genera efectos no deseados que sólo pueden detectarse con una selección escrupulosa. «Como campo, no sabemos demasiado acerca de los datos de los ensayos clínicos relacionados, por ejemplo, con eliminaciones de largo alcance», señaló Ferrari.

Brusson dijo: «En el futuro, necesitaremos una tecnología más potente para caracterizar mejor los efectos genotóxicos de la tecnología de edición básica y principal».

Miccio y su equipo están explorando edición del epigenoma como herramienta alternativa para modular genes en terapia.10 Estas herramientas activan o reprimen genes modificando la estructura de la cromatina y no introducen mutaciones en el genoma. “Esta sería, en teoría, la mejor y más segura estrategia que definitivamente evitaría todos estos efectos genotóxicos porque no existe ninguna enzima que modifique el ADN”, dijo.

Los reguladores del Reino Unido aprobaron recientemente CRISPR-Cas9 para el tratamiento de la anemia de células falciformes y la β-talasemia, y los investigadores ya han utilizado células editadas con bases. para tratar la leucemia en una niña de 13 años en el Reino Unido.11 Aunque estas herramientas de edición tienen el potencial de salvar vidas, este estudio sugiere que puede valer la pena examinar más a fondo sus riesgos genotóxicos.

Referencias

  1. Doudna JA y Charpentier E. La nueva frontera de la ingeniería genómica con CRISPR-Cas9. Ciencia. 2014;346(6213):1258096.
  2. Kantor A, et al. Edición de base y edición principal de ADN CRISPR-Cas9. Int J Mol Ciencia. 2020;21(17):6240.
  3. Fiumara M, et al. Efectos genotóxicos de la edición básica y primaria en células madre hematopoyéticas humanas.. Biotecnología Nat. 2023;s41587-023-01915-4.
  4. Gabriel R, et al. Un análisis imparcial de todo el genoma de la especificidad de la nucleasa con dedos de zinc. Biotecnología Nat. 2011;29:816-823.
  5. Ferrari S, et al. Edición eficiente de genes de células madre hematopoyéticas humanas a largo plazo validada mediante seguimiento clonal. Biotecnología Nat. 2020;38(4):1298-1308.
  6. Antoniou P, et al. Tecnologías de edición base y principal para trastornos sanguíneos.. Ed. Genoma frontal. 2021;3:61846.
  7. Feroz W y Sheikh AMA. Explorando las múltiples funciones de guardián del genoma: P53. Egipto J Med Hum Genet. 2020;21(49):s43042-020-00089-x.
  8. Schubert MS, et al. Modificación química de CRISPR. ARNg eliminar las respuestas del interferón tipo I en células mononucleares de sangre periférica humana. J citocina biol. 2018;3(21):121.
  9. Gerstel B, et al. Los efectos de la protección 5′, la poliadenilación 3′ y la composición líder sobre la traducción y estabilidad del ARNm en un extracto libre de células derivado de la levadura Saccharomyces cerevisiae. microbiol mol. 1992;6(16):2339-2348.
  10. Syding LM, et al. Potencial de edición del epigenoma CRISPR/Cas9 para enfermedades de impronta raras: una revisión. Células. 2020;9(4):993.
  11. Chiesa R, et al. Células T CAR7 editadas en base para la leucemia linfoblástica aguda de células T recidivante. NEJM. 2023;389:899-910.