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W.uando siguen viejos protocolos de laboratorio, los investigadores pueden sentirse como Hermione en Harry Potter y el Príncipe Mestizo.1 Aunque siguió meticulosamente la receta del libro de texto para preparar una poderosa poción para dormir llamada «Droga de muerte en vida», fracasó. Para su sorpresa y frustración, su amigo Harry preparó con éxito la poción durante su primer intento y recibió entusiastas elogios de su maestro porque siguió una receta alterada escrita a mano. De manera similar, los investigadores suelen modificar los protocolos publicados para obtener mejores resultados. Ya sea que los ajustes sean menores o significativos, estas “recetas secretas” a menudo permanecen con los investigadores o en sus archivos de laboratorio. Incluso si se publican protocolos modificados, la falta de consenso sobre un método significa que un recién llegado tendría que dedicar mucho tiempo a solucionar problemas para obtener resultados óptimos.

Tomemos como ejemplo el protocolo para el cultivo de neuronas corticales. Para cultivar neuronas corticales, los investigadores añaden suspensiones de células de corteza disociada a un sustrato recubierto de polilisina (PL) y, una vez que las neuronas corticales se han adherido a él, sumergen las células en un medio apropiado. Investigadores primeras células cerebrales sembradas en placas recubiertas con PL en 1974, y desde entonces tanto la poli-D-lisina (PDL) como la poli-L-lisina (PLL), las dos formas existentes de PL, se han utilizado ampliamente para cultivos neuronales.2 Sin embargo, no existe consenso sobre la receta para preparar la solución de PL o el procedimiento de recubrimiento del sustrato. Por lo tanto, mantener las neuronas corticales en cultivo durante un tiempo prolongado sigue siendo un desafío.

A la neurocientífica Aurélie Stil le apasiona compartir su “receta secreta” para el crecimiento de neuronas corticales con otros investigadores.

Jean-Bernard Stil

Aurélie Stilinvestigador en Jean-François Boucharden la Universidad de Montreal, enfrentó este problema cuando no logró mantener de manera confiable los cultivos neuronales sanos que necesitaba para estudiar la guía de los axones, el crecimiento de los axones y la formación de sinapsis. Para superar este problema, se asoció con ingenieros químicos y juntos idearon un protocolo de recubrimiento PDL simple que mejoraba de manera confiable la adhesión y maduración de las neuronas corticales in vitro. Recientemente publicaron su protocolo en Fronteras en la neurociencia celular.3 En una entrevista con El científico, Stil explicó cómo surgió el nuevo protocolo y por qué decidió publicarlo.

¿Cuándo empezó a optimizar el protocolo para cultivar neuronas corticales primarias?

Casi inmediatamente después de empezar a trabajar con cultivos neuronales, tuve problemas. Si tuviera cinco platos, tal vez uno sería bueno. Fue realmente difícil hacer mis experimentos. Sentí que el protocolo que estaba siguiendo necesitaba optimización.

¿Qué te hizo buscar ayuda de tus colegas ingenieros químicos?

Después de un tiempo, tuve suficiente y quise solucionar el problema. Hablé con otros investigadores que trabajan con cultivos neuronales primarios y me dijeron que no era gran cosa: era lo que se esperaba de los cultivos primarios. Sin embargo, eso no fue suficiente para mí. Probé algunos otros protocolos, pero obtuve resultados deficientes similares. Mi hipótesis fue que un procedimiento de recubrimiento subóptimo podría estar causando esto.

Fue entonces cuando hablé con algunos ingenieros químicos porque pensé que, con su conocimiento de la adhesión electrostática, podrían ayudarme a encontrar un protocolo de recubrimiento óptimo. Así empezó nuestra colaboración. Hablamos y probamos diferentes cosas y finalmente se nos ocurrió algo que funcionó.

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¿Por qué decidiste publicar tu nuevo protocolo?

Al principio, mis colegas ingenieros químicos simplemente querían ayudar con mi propia investigación, pero si encontrábamos algo interesante, quería publicarlo. No quería quedarme con la receta. Al hablar con otros científicos en reuniones y conferencias, me di cuenta de que no compartir los resultados de experimentos fallidos o los ajustes necesarios para que un experimento funcione es un problema común.

A menudo, corresponde al estudiante de posgrado o al investigador postdoctoral resolver estos problemas técnicos porque los protocolos previamente optimizados no siempre se publican. No estoy de acuerdo con esa práctica. Cuando nos desviamos de un protocolo publicado para obtener nuestros resultados, tenemos que compartirlo con la comunidad científica.

Entonces, cuando vimos cultivos neuronales consistentemente sanos con el nuevo método, me emocioné mucho. No ha habido una actualización de los protocolos antiguos publicados y espero que el protocolo que describimos en nuestro artículo ayude a muchos investigadores que trabajan con cultivos de células neuronales corticales.

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¿Cómo estuvieron a la altura las neuronas cultivadas según el nuevo protocolo?

Observamos diferencias en las neuronas que crecimos siguiendo otros protocolos publicados y el nuestro. Las células de nuestro protocolo eran más sanas y formaban redes neuronales más elaboradas y complejas, por ejemplo. Descubrimos que el procedimiento de recubrimiento puede influir en las propiedades neuronales; es similar a las diferencias que se observan cuando se recolectan células de diferentes cepas de ratones y se miden sus propiedades electrofisiológicas. Para mantener la coherencia, los investigadores deben mantener el mismo sustrato de cultivo para todos los experimentos.

¿Sabes si tu protocolo funciona de manera similar en diferentes tipos de neuronas?

Todavía no, pero planeamos probar si nuestro protocolo se mantiene en diferentes tipos de células. Ahora que tenemos un protocolo optimizado, es hora de realizar los experimentos reales.

Esta entrevista ha sido condensada y editada para mayor claridad.

Referencias:

  1. J. K. Rowling. Harry Potter y el Príncipe Mestizo. Escolar Inc. 2005.
  2. Yavin E, Yavin Z. Adjunción y cultivo de células disociadas de hemisferios cerebrales de embriones de rata sobre una superficie recubierta de polilisina.. j Biol celular. 1974;62(2):540-546.
  3. Estilo A, et al. Un método simple de recubrimiento de poli-D-lisina para mejorar la adhesión y maduración de cultivos de neuronas corticales primarias in vitro. Neurociencias de células frontales. 2023;17:1212097.