W.Cuando un chef desarrolla una nueva receta, agrega y elimina metódicamente ingredientes individuales para ver cómo cada uno de ellos altera el plato final. Cuando los científicos intentan comprender el papel de los genes en el cuerpo, emplean una táctica similar mediante la edición del genoma. Actualmente, la herramienta más popular en su caja de herramientas es CRISPRcon aplicaciones que van desde terapias contra el cáncer hasta tratamientos para enfermedades genéticas como la anemia falciforme y la β-talasemia.1 Sin embargo, este elemento básico de edición del genoma todavía tiene sus limitaciones.
«Es realmente difícil empaquetar los genes que codifican estas proteínas en los virus que se utilizan para su transporte a las células», dijo Tautvydas Karvelisbiólogo genómico de la Universidad de Vilnius. Incluso cuando las nucleasas CRISPR se administran directamente a las células, el gran tamaño de sus proteínas presenta limitaciones. Por ejemplo, el Cas9 comúnmente utilizado tiene aproximadamente 1.400 residuos de aminoácidos de longitud.
En un estudio reciente publicado en Métodos de la naturaleza, Gerald Schwankbiólogo genómico de la Universidad de Zurich, y su equipo describieron una nucleasa pequeña, pero eficiente, que funciona tan bien como algunas de las proteínas Cas actuales, pero que tiene menos de la mitad de su tamaño.2
«Es como una nueva clase de herramientas que pueden usarse para la edición del genoma, no sólo como un principio», dijo Karvelis, que no participó en el estudio.
En 2021, Karvelis descubrió una proteína compacta guiada por ARN capaz de cortar el ADN: tnpb.3 En comparación con otras nucleasas CRISPR, TnpB es mucho más pequeña con aproximadamente 400 residuos de aminoácidos. Sin embargo, TnpB tiene una menor eficiencia de edición y un rango objetivo limitado.
Por ello, Schwank se propuso mejorar el rendimiento de TnpB. Él y su equipo optimizaron TnpB para la edición de genes de mamíferos y diseñaron variantes de las proteínas para mejorar el rango objetivo. También construyeron un modelo de aprendizaje automático para predecir qué tan bien funcionará un ARN guía para un conjunto de secuencias objetivo, ahorrando a los futuros usuarios el dolor de cabeza de múltiples ensayos.
En su estado inalterado, la eficiencia de edición de TnpB está entre cero y 20 por ciento, que es menor que la del ortólogo CRISPR-Cas9 más pequeño. cjCas9. «Nos preguntamos si realmente podíamos hacer que TnpB fuera lo suficientemente eficiente como para usarlo», dijo Schwank. Entonces el equipo hizo dos cosas. Optimizaron la secuencia de codones de TnpB para células de mamíferos y adjuntaron una pequeña etiqueta a la proteína que la guió hasta el núcleo. El equipo observó un aumento de 4,4 veces en la eficiencia de edición de esta nucleasa modificada, superando a la mayoría de las endonucleasas guiadas por ARN comúnmente utilizadas, incluidas cjCas9. A esta variante la llamaron TnpBmax.
Cuando se probó en una gran biblioteca de sitios objetivo insertados en células de mamíferos, TnpBmax tuvo un desempeño notable, provocando inserciones y eliminaciones de secuencias de ADN a una tasa de aproximadamente el 70 por ciento. Pero cualquier cambio en una región esencial de cinco bases aguas arriba del objetivo del ADN provocó que la eficiencia cayera drásticamente. Esta región corta con la secuencia 5’TTGAT 3′, llamada motivo transposón adyacente (TAM), ocurre con poca frecuencia y limita dónde TnpBmax puede hacer su magia.
Para relajar estos límites, Schwank y el equipo probaron las interacciones entre diferentes versiones de TnpBmax y variantes TAM. Reemplazo de lisina por alanina en el 76th La posición permitió a TnpBmax reconocer TAM que tenían citosina o timina en la segunda posición y guanina o timina en la tercera posición. Esta secuencia ocurre cuatro veces más en el genoma que la TAM original. Los cambios a TnpBmax o TAM no afectaron la eficiencia de la edición.
Schwank quería incluir una función adicional a la herramienta. Él y su equipo construyeron un modelo que puede predecir si una secuencia de ARN guía puede editar una secuencia de ADN determinada con una eficiencia de al menos el 70 por ciento. “Antes era más o menos una apuesta. Tener un sitio TAM significaba que, en principio, el sitio debería ser accesible, pero no se sabía realmente si habría una eficiencia sustancial”, dijo Schwank. «Ahora, con este modelo, es mucho más fácil determinar si se puede utilizar la herramienta o no».
“Tener este modelo para que la gente pueda diseñar sus propias guías ayudará con la usabilidad del sistema”, dijo Omar Abudayyehun ingeniero genómico de la Facultad de Medicina de Harvard que no participó en el estudio.
Finalmente, para poner la herramienta a prueba, los autores se centraron en genes del cerebro y el hígado de ratones. Observaron eficiencias de edición del 65 por ciento y 75 por ciento, respectivamente. En el hígado, el equipo editó un gen implicado en el metabolismo del colesterol y observó la consiguiente disminución de los niveles de colesterol en sangre en los ratones.
«En el momento de su descubrimiento, había una gran pregunta sobre cuán efectivas serían las TnpB como enzimas de edición del genoma», dijo Jonathan Gootenbergun ingeniero genómico de la Facultad de Medicina de Harvard que no participó en el estudio. «Con esta ingeniería, son realmente competitivos».