Una doble cerradura bloquea la señalización del calcio

CEl calcio desencadena una variedad de procesos biológicos, pero algunos de los mecanismos que regulan su liberación eludieron a los científicos durante décadas. Ahora, una colaboración internacional dio lugar a dos artículos publicados en Señalización científica sobre el mecanismos que abren las compuertas del calcio, revelando una ruta potencial a terapias novedosas mientras se resuelve un debate en el camino.^1,2

Los canales iónicos expresados ​​en orgánulos actúan como guardianes, controlando el paso del calcio desde las reservas internas al citosol. El ácido nicotínico adenina dinucleótido fosfato (NAADP) es una de las muchas llaves que abren la puerta. Descubierto por primera vez a finales de los años 1980 en huevos de erizo de mar y luego encontrado en células mamíferasNAADP desencadena la liberación de calcio de almacenes lisosomales a través de la activación del canal iónico, específicamente un canal de dos poros (TPC).^3-6

“NAADP es un segundo mensajero muy curioso”, dijo Jonathan Marchant, biólogo celular del Medical College of Wisconsin y coautor de los artículos. Aunque es un potente desencadenante de la liberación de calcio, los investigadores nunca descubrieron un sitio de unión directa, o un ojo de cerradura, para NAADP en TPC. Luego, dos artículos publicados en 2021, incluido uno del equipo de Marchant, proporcionó una enlace perdido.^7,8 Los estudios revelaron la identidad molecular de una proteína, el homólogo 2 asociado a los microtúbulos de Júpiter (JPT2), que facilita la unión de NAADP a TPC. Si NAADP es el mango de la llave, entonces JPT2 es como la hoja que se inserta en el TPC para abrir sus compuertas.

Sumándose al entusiasmo en el campo, otro artículo publicado ese mismo año identificó otra cuchilla: la proteína proteína similar Sm 12 (LSM12)—que vinculaba a la NAADP con el TPC.⁹ “La gente siempre bromea diciendo que esperas a que llegue un autobús y luego llegan tres autobuses al mismo tiempo”, dijo Marchant. Tras la aparición de dos reguladores prometedores de NAADP, muchos investigadores cuestionaron posibles redundancias, sugiriendo que una proteína puede ser más importante que la otra.

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Para determinar qué proteína fue la auténtica hoja clave de la NAADP, Marchant, junto con el coautor e investigador postdoctoral Gihan Gunaratnerealizó una comparación lado a lado estrechamente controlada de JPT2 y LSM12.¹

Para ello, examinaron tres criterios: selectividad, vinculante y esencialidad. Primero, JPT2 y LSM12 exhibieron una unión selectiva y de alta afinidad a NAADP, medida mediante ensayos de unión de radioligandos y interferometría de biocapa (BLI). Esta última es una técnica de biodetección óptica que proporciona información sobre la cinética de unión de NAADP. La inmersión de una sonda recubierta con JPT2 o SLM12 biotinilado en pocillos que contenían NAADP permitió a los investigadores rastrear la unión de proteínas en tiempo real. En comparación con los pocillos que contienen NADP (una molécula similar que no desencadena la liberación de calcio), JPT2 y LSM12 demostraron una selectividad significativamente mayor para NAADP.

A continuación, para probar si las dos proteínas también encajan en TPC, el equipo de Marchant realizó experimentos de inmunoprecipitación. Descubrieron que ambas proteínas interactuaban con TPC de forma independiente. Por último, los experimentos de eliminación in vitro revelaron la necesidad de que tanto JPT2 como LSM12 no solo desbloquearan la señalización del calcio sino también otras funciones celulares dependientes de NAADP. Cuando los investigadores agregaron NAADP a las células que carecían de JPT2 o LSM12, no observaron aumentos en el calcio citoplasmático, mientras que las células knockout para JPT1 exhibieron calcio elevado. La actividad de TPC también desempeña un papel en el tráfico viral en el sistema endolisosomal. Cuando Marchant y su equipo monitorearon el tránsito de diferentes proteínas de pico de coronavirus en las células, observaron una infección reducida en las células que carecían de JPT2 y LSM12. Estos hallazgos sugieren que las proteínas de unión a NAADP, además de activar la liberación de calcio, desempeñan un papel integral en la mediación del escape viral de los lisosomas.

“Lo notable de este último artículo del grupo de Marchant es que parece sugerir que es necesario ambos JTP2 y LSM12 para unirse a NAADP e interactuar con el canal para abrirlo”, dijo Antonio Galione, farmacólogo de la Universidad de Oxford que no participó en el estudio. “Una proteína de unión cargada con NAADP no es suficiente, lo que en realidad es una regulación bastante controlada”. Por lo tanto, TPC cuenta con un sistema de doble bloqueo para controlar las actividades dependientes del NAADP.

TPC es tan curioso como NAADP. Los científicos creyeron durante mucho tiempo que la selectividad iónica era una característica inmutable de los canales iónicos. Sin embargo, los científicos descubrieron que el TPC también regula el sodio mediante la unión directa del fosfatidilinositol 3,5-bisfosfato (PI(3,5)P₂).

Sandip Patelbiólogo celular del University College London y coautor de los artículos, ayudó a descubrir dos pequeñas moléculas que desencadenan la liberación de calcio o sodio del TPC, proporcionando un medio sintético para regular la actividad del canal.¹⁰ En el artículo adjunto, Patel se asoció con Marchant y Taufiq Rahmanfarmacólogo de la Universidad de Cambridge, para probar si el agonista sintético que imitaba al NAADP requería de manera similar ambas proteínas para evocar señales de calcio.²

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Cuando los investigadores eliminaron JPT2 o LSM12 de las células, descubrieron que el mimético NAADP todavía evocaba señales de calcio, proporcionando las primeras pistas de que esta pequeña molécula opera utilizando un sistema de cerradura y llave alternativo al NAADP. en un anterior estudiarel equipo de Patel encontró que NAADP y PI(3,5)P₂ hacen sinergia para aumentar las señales de calcio, por lo que probaron el requisito del conocido TPC PI(3,5)P₂ Sitio de unión para la liberación de calcio provocada.¹¹ Para su sorpresa, la mutación del PI(3,5)P₂ El sitio de unión bloqueó los efectos del NAADP, pero no el mimético sintético.

“Esa fue una extraña convergencia entre dos moléculas completamente diferentes que activan el canal y tienen dos salidas completamente diferentes (unas relacionadas con el calcio y otras relacionadas con el sodio), pero parecen converger en este sitio de unión común”, dijo Patel.

Aunque los investigadores todavía no entienden completamente cómo este mimético NAADP de llave dorada activa el TPC, realizaron experimentos iniciales de mutagénesis dirigida al sitio que apuntan a una parte del canal, la región críptica de detección de voltaje, que era necesaria para las acciones del mimético pero no NAADP.

Estos experimentos resaltan diferencias mecanísticas entre NAADP y el mimético, pero Galione notó una limitación de la mutagénesis. La mutación proteica de un sitio o dominio específico puede tener amplios efectos en el comportamiento del canal, lo que a menudo dificulta atribuir una función específica a un aminoácido determinado. “A pesar de estas preocupaciones, algunas de estas proteínas mutadas son valiosas para intentar analizar las modalidades de regulación de los canales”, dijo Galione.

Cada vez hay más pruebas de que los TPC son importante o disfuncional en enfermedades infecciosas, enfermedad del hígado graso y enfermedad de Parkinson.¹² “Tal vez podamos evitar estas proteínas de unión con nuestros medicamentos”, dijo Patel. “En otras palabras, si las proteínas de unión fueran defectuosas de alguna manera, digamos una enfermedad, entonces, como hemos descubierto que estos activadores químicos pueden evitar estas proteínas de unión, podríamos potencialmente corregir cualquier defecto con estos medicamentos”.

Además de explorar el potencial farmacológico de estos canales y proteínas de unión, Marchant está entusiasmado de analizar cómo, a nivel molecular, las dos proteínas interactúan con NAADP y TPC, e incluso entre sí. “Hay algunas propiedades sorprendentes de estas proteínas que todavía no hemos comprendido del todo”, dijo Marchant.

Referencias

1. Gunaratne GS, et al. Activación convergente de canales de dos poros mediada por las proteínas de unión a NAADP JPT2 y LSM12. Señal de ciencia. 2023;16(799):eadg0485.
2. Saito R, et al. Activación convergente de Ca²⁺ permeabilidad en el canal 2 de dos poros a través de distintas rutas moleculares. Señal de ciencia. 2023;16(799):eadg0661.
3. Clapper DL, et al. Los metabolitos de nucleótidos de piridina estimulan la liberación de calcio de los microsomas de huevos de erizo de mar insensibilizados al trifosfato de inositol.. J Biol Chem. 1987;262(20):9561-9568.
4. Cancela JM, et al. Coordinación del Ca inducido por agonistas²⁺-patrones de señalización por NAADP en células acinares pancreáticas. Naturaleza. 1999;398(6722):74-76.
5. Churchill GC, et al. NAADP moviliza Ca²⁺ de gránulos de reserva, orgánulos relacionados con lisosomas, en huevos de erizo de mar. Celúla. 2002;111(5):703-708.
6. Calcraft PJ, et al. NAADP moviliza calcio de orgánulos ácidos a través de canales de dos poros. Naturaleza. 2009;459(7246):596-600.
7. Gunaratne GS, et al. Requisito esencial para JPT2 en Ca evocado por NAADP²⁺ señalización. Señal de ciencia. 2021;14(675):eabd5605.
8. Roggenkamp HG, et al. HN1L/JPT2: una proteína de señalización que conecta la generación de NAADP con la formación de microdominios de Ca2+. Señal de ciencia. 2021;14(675):eabd5647.
9. Zhang J, et al. Lsm12 es un receptor NAADP y una proteína reguladora del canal de dos poros necesaria para la movilización de calcio a partir de orgánulos ácidos.. Comuna Nacional. 2021;12:4739.
10. Gerndt S, et al. El cambio de selectividad iónica mediado por agonistas en TPC2 promueve diferencialmente la función lisosomal. eVida. 2020;9:e54712.
11. Yuan Y, et al. Flujo de cationes segregados por sesgos de TPC2 Ca²⁺ señalización a través de lisosomas. comuna nacional. 2022;13:4481.
12. Patel S. Función y disfunción de canales de dos poros.. Señal de ciencia. 2015;8(384):eaab3314.