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tGracias a herramientas de edición genética como CRISPR-Cas Gracias a estas tecnologías, los investigadores ahora pueden insertar, eliminar o reemplazar ADN genómico en sitios objetivo específicos para inactivar genes, adquirir nuevos rasgos y corregir mutaciones genéticas.1 El conocido sistema CRISPR-Cas9 se basa en un ARN guía que dirige la enzima Cas9 a una secuencia de ADN deseada, que la enzima corta, formando roturas de doble hebra (DSB). Una aplicación importante de la tecnología CRISPR-Cas9 es potencialmente aumentar la respuesta inmune en pacientes con cáncer mediante la ingeniería de células T autólogas para atacar y destruir las células tumorales.2

Si bien la edición del genoma CRISPR-Cas9 permite terapias avanzadas con células T, los científicos han preocupaciones de seguridad.3 La reparación inadecuada de DSB puede provocar la pérdida de cromosomas dirigidos a Cas9, pero estos efectos no deseados siguen en gran medida inexplorados. «Hubo un par de artículos en el campo que mostraron esto [chromosome loss]pero nada que fuera muy completo”, dijo Connor Tsuchida de la Universidad de California, Berkley y fundador de la empresa de biotecnología Stealth Startup. En su artículo recientemente publicado en CelúlaTsuchida y sus colegas informaron cuán extendida estaba la pérdida cromosómica inducida por Cas9 al editar células T humanas.4

Para investigar cómo la edición del gen Cas9 afectaba a las células T, los investigadores se centraron en el primer exón del TRAC locus, que codifica el receptor de células T en el cromosoma 14. Como se esperaba, los resultados de la secuenciación de ADN mostraron que el locus deseado fue editado. Sin embargo, cuando los investigadores analizaron los datos de secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq) de todo el transcriptoma de las células, detectaron una dosis reducida de genes en el cromosoma 14 y encontraron que entre el cinco y el 20 por ciento de las células T presentaban una pérdida cromosómica parcial o total.

Para observar más a fondo el fenómeno de la pérdida de cromosomas, Tsuchida y sus colegas utilizaron CRISPR-Cas9 para editar múltiples genes en cada cromosoma somático. Descubrieron que la pérdida de cromosomas se producía en casi el 90 por ciento de todos los objetivos, sin importar dónde se produjera la edición. En conjunto, estos resultados sugirieron que la pérdida de cromosomas debido a la edición del genoma de las células T es una característica general de la edición de Cas9 en los sitios objetivo.

Luego, los investigadores evaluaron las consecuencias de la pérdida de cromosomas inducida por Cas9. Monitorearon las células editadas in vitro durante dos o tres semanas, un período de tiempo similar a los protocolos de fabricación de terapias clínicas adoptivas actuales con células T, y descubrieron que, aunque estas células sobrevivieron, tenían niveles detectables de pérdida de cromosomas en todo momento y mostraron una proliferación y aptitud reducidas. Por lo tanto, las células T comprometidas con pérdida de cromosomas inducida por Cas9 podrían persistir el tiempo suficiente durante la fabricación de la terapia celular para terminar en los pacientes. Los investigadores también observaron una sobreexpresión significativa de dos módulos genéticos en estas células: la respuesta al daño del ADN p53 y las vías generales de apoptosis.

Los investigadores se preguntaron si podrían encontrar evidencia de pérdida de cromosomas de células T modificadas genéticamente en los ensayos clínicos existentes.2 Investigaron los datos de scRNA-seq a lo largo de un ensayo completado en 2020, en el que pacientes con cáncer refractario avanzado recibieron células T editadas con CRISPR-Cas9, llamadas células editadas con CRISPR 3X transducidas con NY-ESO-1 (células NYCE). “No encontramos ninguna [chromosome loss] en absoluto, lo cual fue sorprendente para nosotros”, dijo Tsuchida.

Después de investigar varios factores que pueden explicar esta discrepancia, Tsuchida y sus colegas encontraron una diferencia clave en el protocolo de ingeniería de células T del ensayo clínico. En el estudio de Tsuchida, y en casi todos los demás ensayos clínicos que probaron células T editadas con genoma, la edición CRISPR se produjo después de la activación y estimulación de las células T. Por el contrario, las células NYCE se editaron antes de la activación, lo que puede haber disminuido la pérdida de cromosomas.

“Lo importante es que [Tsuchida’s team] demostró una manera de mitigar la pérdida involuntaria de cromosomas cambiando el protocolo”, dijo Ayal Hendel, un investigador de edición CRISPR de la Universidad Bar-Ilan, que no participó en este estudio. “Demostraron que si primero se toman las células T, se inducen las ediciones y sólo después se comienza con la activación… se obtiene menos pérdida de cromosomas. Éste es el principal aspecto nuevo de este documento”.

Para comprender mejor la diferencia entre estos dos protocolos, los investigadores observaron TP53 expresión. Este gen codifica la proteína p53 implicada en la respuesta al daño del ADN y la activación de las células T. encontraron que TP53 La expresión después de la edición CRISPR-Cas9 se correlacionó inversamente con las tasas de pérdida cromosómica. Los investigadores especularon que al diseñar células NYCE, se obtenían altas TP53 La expresión puede haber favorecido a las células con cromosomas intactos. Modular p53 siguiendo el protocolo NYCE puede ayudar a proteger las células diseñadas con CRISPR contra la aneuploidía. “[Treating cells] con moléculas pequeñas que activan p53 o inactivan un inhibidor de p53 antes de la edición del genoma… puede [offer] protección transitoria”, planteó Tsuchida. «Es algo en lo que estamos interesados».

Referencias:

  1. Xu Y, et al. Sistemas CRISPR-Cas: descripción general, innovaciones y aplicaciones en la investigación de enfermedades humanas y la terapia génica. Comput Struct Biotecnología J. 2020;18:2401-2415.
  2. Stadtmauer EA, et al. Células T diseñadas con CRISPR en pacientes con cáncer refractario. Ciencia. 2020;367(6481):eaba7365.
  3. Nahmad AD, et al. Aneuploidía frecuente en células T humanas primarias después de la escisión de CRISPR-Cas9. Biotecnología Nat. 2022;40(12):1807-1813.
  4. Tsuchida CA, et al. Mitigación de la pérdida de cromosomas en células T clínicas diseñadas con CRISPR-Cas9. Celúla. 2023;186(21):4567-4582.e20.