FDesde la biología sintética y la terapia genética hasta el almacenamiento de datos y la producción de biocombustibles, la demanda de ADN sintético está aumentando.
Síntesis química
La síntesis de oligonucleótidos de fosforamidita es el método estándar de oro para generar ADN sintético. Los científicos utilizan este método para ensamblar nucleótidos modificados (nucleósidos de fosforamidita) con la ayuda de productos químicos.1
(1) Los productos químicos eliminan el grupo protector 5′-hidroxilo.
Los nucleósidos son ricos en grupos hidroxilo y amino expuestos, por lo que los científicos utilizan grupos protectores para evitar reacciones no deseadas con compuestos utilizados en la síntesis de ADN. Los productos químicos eliminan los grupos protectores para facilitar el acoplamiento de nucleósidos.
(2) Los productos químicos desplazan el grupo diisopropilamino.
(3) Los productos químicos tapan los grupos 5′-hidroxilo que no han reaccionado.
Un paso de oxidación crea un acoplamiento más estable. El oligonucleótido está listo para otra ronda de síntesis.
(4) Los productos químicos estabilizan el acoplamiento.
Una vez que el oligonucleótido alcanza la longitud deseada, productos químicos adicionales eliminan los grupos protectores restantes y escinden la cadena de su soporte sólido.
(5) Los productos químicos escinden el oligonucleótido y eliminan los grupos protectores.
(6) La exposición continua a productos químicos agresivos daña el ADN y reduce los rendimientos. Los científicos utilizan oligonucleótidos cortos como cebadores para la reacción en cadena de la polimerasa y la secuenciación de próxima generación, en micromatrices de ADN e hibridación fluorescente in situ, y en terapias antisentido.
Síntesis enzimática
La síntesis enzimática de ADN es una tecnología emergente que ofrece varias ventajas sobre los métodos químicos. Los científicos utilizan dos enfoques principales para lograr un ensamblaje de oligonucleótidos independiente de la plantilla.2
(1) Los enfoques de trifosfato de desoxinucleótido protegido (dNTP) y dNTP atado utilizan desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT), una ADN polimerasa única y especializada que no requiere una plantilla de cebador para construir ADN.
(2) Un dNTP protegido entrante o un conjugado TdT-dNTP unido se acopla a la base agregada previamente.
(3) Reactivos de lavado acuosos y suaves.
El paso de desbloqueo o desvinculación va seguido de un paso de lavado para eliminar cualquier reactivo restante, incluidos agentes bloqueantes, enzimas y dNTP no unido. El oligonucleótido está listo para otra ronda de síntesis.
(4) Un reactivo de escisión separa el oligonucleótido de la base.
Una vez que se alcanza la longitud deseada, los productos químicos escinden el oligonucleótido del soporte sólido.
(5) Las reacciones ocurren en condiciones acuosas suaves, lo que limita el uso de productos químicos agresivos que causan daños al ADN. Por lo tanto, los enfoques enzimáticos pueden generar cadenas más largas, como fragmentos de genes, con una menor tasa de error.
Referencias
- Hoose A, et al. Tecnologías de síntesis de ADN para cerrar la brecha en la escritura de genes. Nacional Rev Chem. 2023;7(3):144-161.
- Jensen MA, Davis RW. Síntesis de oligonucleótidos enzimáticos independientes de la plantilla (TiEOS): su historia, perspectivas y desafíos. Bioquímica. 2018;57(12):1821-1832.
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