Integración genética dirigida para aplicaciones de alto rendimiento

tLa edición genómica dirigida logró grandes avances en las últimas décadas, especialmente gracias a la llegada de sistemas de edición de genes basados ​​en endonucleasas como CRISPR-Cas9. Sin embargo, la inserción selectiva de cargas útiles más grandes sigue siendo problemática, lo que obstaculiza lo que los investigadores pueden hacer en términos de capacidad y rendimiento. Richard Davisinvestigador de células madre del Centro Médico de la Universidad de Leiden (LUMC) e investigador asociado del Centro de Medicina de Células Madre de la Fundación Novo Nordisk (reNEW), cree que un nueva estrategiadenominada integración de genes asistida por serina y tirosina recombinasa para investigaciones de alto rendimiento (STRAIGHT-IN), puede brindar a los científicos una nueva y poderosa herramienta para la investigación y las aplicaciones clínicas.¹

Edición genómica de precisión se basa sobre reparación dirigida por homología (HDR) para incorporar ADN del donante en regiones específicas.² Sin embargo, la eficiencia de la orientación HDR disminuye significativamente a medida que aumenta el tamaño de la inserción, por lo que insertar cargas útiles de varios kilos de base sigue siendo difícil.³ La recombinación de sitio específico puede abordar este problema, y ​​Davis y su equipo de LUMC utilizaron las fortalezas de dos clases principales de recombinasa de sitio específico (SSR) para construir STRAIGHT-IN. “Las serina recombinasas pueden introducir construcciones rápidamente, pero todo el vector (la columna vertebral, el plásmido, todo) se integrará”, dijo Davis. “Sabíamos por experiencia que si estos [unnecessary] Se mantuvieron las secuencias, habrá silenciamiento en el camino que impedirá la expresión. Entonces, utilizamos tirosina recombinasas para eliminar estas secuencias auxiliares que no eran necesarias en la línea celular final”.

Los hallazgos de Davis y su equipo, publicado en Métodos de informes celularesdemostraron que STRAIGHT-IN facilitó la integración o sustitución dirigida de fragmentos genómicos de múltiples kilobases dejando solo rastros (menos de 300 pares de bases) de ADN principal del plásmido.¹ Esta capacidad es importante para crear sistemas fisiológicamente más relevantes. “Queríamos mantener todos los [endogenous] intrones y elementos reguladores; para conservar todo el contexto genómico del gen”, explicó Davis. Davis también señaló que en el pasado, la inserción de grandes cargas útiles a menudo requería manipulaciones de genomas celulares que pudieran alterar el fenotipo. Esto fue particularmente problemático para los investigadores de células madre. “Estas modificaciones adicionales podrían implicar la eliminación o sobreexpresión de ciertos genes, lo que luego afectaría su fenotipo y su capacidad de diferenciación”, dijo Davis.

Los investigadores diseñaron STRAIGHT-IN teniendo en cuenta las células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC), ya que el potencial de las células para la investigación de enfermedades se había visto obstaculizado porque eran más difíciles de modificar genéticamente en comparación con las líneas celulares inmortalizadas. “La tecnología STRAIGHT-IN desempeñará un papel en la fabricación [hiPSC] modelos más útiles”, dijo David Larga Espada, genetista de la Facultad de Medicina de la Universidad de Minnesota que no participó en este estudio. “Por ejemplo, tenemos problemas para imitar lo que sucede en los genomas del cáncer humano en ratones porque los cromosomas murinos son diferentes. Con los modelos hiPSC, podríamos modelar cosas más relevantes para el cáncer humano, como eventos de amplificación de genes, eventos de secuestro de potenciadores, etc. “

Además de la capacidad, Davis y su equipo querían mejorar la velocidad y el rendimiento de la generación de modelos. Desarrollaron un procedimiento en el que reemplazaron el gen de interés con un casete de plataforma de aterrizaje que contiene sitios de reconocimiento y unión de SSR, creando una “línea celular aceptora” que sirve como plantilla para futuras manipulaciones. Ahora, se podría insertar el gen original de interés o una variante sin necesidad de desarrollar un procedimiento completamente nuevo cada vez, y la secuencia se colocaría dentro de su contexto genómico endógeno. “Normalmente, la focalización en Cas9 requiere de tres a seis meses”, explicó Davis. “Pero tener un sistema en el que alguien pueda reintroducir rápidamente el gen con diferentes variantes es mucho más rápido, incluso con el tiempo necesario para establecerlo”. Este enfoque también permitió la multiplexación, que Davis y sus colegas demostraron introduciendo plásmidos para doce mutaciones diferentes en una población celular y recuperando once de ellos a partir de una sola transfección.

El potencial de STRAIGHT-IN quizás se muestre mejor en su techo alto. Davis y otros en el campo ya están abordando los obstáculos inmediatos, como buscar SSR potencialmente mejores y trabajar en la entrega a células diferenciadas. El equipo de Davis ya introducido STRAIGHT-IN v2, que eliminó la necesidad de un paso de aislamiento clonal al lograr una eficiencia del 100 por ciento.⁴ Finalmente, Largaespada señaló que Davis y su equipo han puesto a disposición de otros científicos tanto vectores como líneas celulares con sitios SSR ya integrados: “Creo que será bastante fácil [bring in] y a escala: sería bastante factible para muchos laboratorios, y lo estamos considerando nosotros mismos”.

Referencias

1. Blanch-Asensio A, et al. STRAIGHT-IN permite la focalización de alto rendimiento en grandes cargas de ADN en células madre pluripotentes humanas. Métodos de representación celular. 2022; 2(10):100300.
2. Miyaoka Y, et al. La cuantificación sistemática de HDR y NHEJ revela efectos del locus, la nucleasa y el tipo de célula en la edición del genoma. Representante de ciencia 2016;6:23549.
3. Zhang M, et al. Ampliando el potencial de la ingeniería del genoma de los mamíferos mediante la integración específica del ADN. Biol sintetizador ACS. 2021;10(3):429-446.
4. Blanch-Asensio A, et al. Generación de líneas iPSC humanas aceptoras AAVS1 y CLYBL STRAIGHT-IN v2 para integrar cargas útiles de ADN. Res de células madre. 2023;66:102991.