AHace aproximadamente una década, CRISPR, abreviatura de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas, fue catapultado desde los humildes reinos de la inmunidad bacteriana adaptativa al centro de la escena en la edición del genoma cuando los investigadores descubrieron que podían reutilizar elementos del sistema inmunológico procariota para cortar el ADN y modificar genes en células humanas.1,2 De la noche a la mañana, el sistema basado en CRISPR revolucionó y democratizó el campo al ofrecer un método más preciso y fácil de usar para realizar modificaciones específicas del sitio. Ahora, los sistemas de edición genómica basados en CRISPR están impulsando la investigación en las ciencias de la vida. Sin embargo, para abordar las limitaciones actuales y ampliar sus aplicaciones, los científicos continúan modificando la tecnología.
CRISPR se expande más allá de la nucleasa Cas9
Los científicos programan CRISPR-Cas9 para introducir roturas de extremos romos en el ADN de doble cadena en los loci genómicos objetivo basándose en motivos adyacentes al protoespaciador (PAM) cercanos y ARN guía único específico del objetivo (sgRNA) diseñados por ingeniería genética. Después de que Cas9 escinde el ADN, el gen objetivo se convierte en un sustrato para la maquinaria de reparación del ADN celular, que cataliza la unión de extremos no homólogos (NHEJ) o los mecanismos de reparación dirigida por homología (HDR) que alteran la expresión génica o introducen nuevas secuencias de ADN.
El científico
Al igual que el sistema inmunológico humano, las bacterias aprenden de infecciones pasadas. Las secuencias CRISPR (fragmentos cortos de ADN de virus anteriores) guían a las enzimas destructivas hacia los bacteriófagos invasores que expresan la misma huella genética. Los científicos se dieron cuenta de que podían editar y alterar la función genética en eucariotas mediante la ingeniería de ARN guía corto personalizable para dirigir a las enzimas a introducir cortes en puntos específicos del genoma. Cas9, la primera proteína Cas reutilizada para cortar ADN, introduce roturas de doble cadena que reclutan maquinaria de reparación del ADN. A pesar de sus éxitos, el sistema CRISPR-Cas9 tiene varias limitaciones, incluido el corte fuera del objetivo. A lo largo de los años, los científicos han explorado alternativas a Cas9, como Cas12a para una edición multigénica más precisa, una CRISPR tipo III para edición de ARNy un Cas13 cargado con múltiples ARN guía para segmentación multiplexada.
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Cómo evitar los efectos no deseados de CRISPR modificando el momento de las modificaciones
Las roturas de ADN de doble cadena no solo abren la puerta a una edición no deseada y fuera de lugar, sino que su reparación inadecuada puede generar problemas de seguridad adicionales cuando se trata de utilizar sistemas CRISPR-Cas9, que tienen Ya llegaron los pacientesLos investigadores que utilizan herramientas de edición genética CRISPR-Cas9 han descubierto que, si bien esta tecnología puede mejorar las terapias contra el cáncer de células T, también puede provocar una pérdida cromosómica no deseada en las células inmunes editadas. Bioquímico Jennifer Doudna y su equipo de la Universidad de California, Berkeley, descubrieron que se producía pérdida de cromosomas en casi el 90 por ciento de todos los genes en cuestión. Al explorar los datos de secuenciación de ARN de células individuales de ensayos clínicos con células T modificadas con CRISPR-Cas9, los investigadores descubrieron que un ensayo clínico que utilizó un protocolo diferente, en el que los científicos editaron las células antes de su activación, no mostró evidencia de pérdida de cromosomas, lo que destaca la importancia del momento.
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La edición básica y principal ofrece precisión
Los sistemas basados en CRISPR que dependen de las nucleasas Cas tradicionales como Cas9 cortan ambas cadenas de ADN, lo que puede dar lugar a ediciones indeseables e incluso peligrosas en el genoma. Por el contrario, los sistemas que utilizan proteínas Cas modificadas o alteradas catalíticamente son menos activos y solo introducen roturas de una sola cadena, o mellas, en el ADN. La edición de bases es un sistema de edición del genoma que utiliza una proteína Cas alterada para impulsar enzimas que crean mutaciones puntuales únicas, como el intercambio de una adenina por una guanina, en una ubicación específica del ADN. Con los avances recientes en la edición de bases, los investigadores ahora pueden Introducir simultáneamente múltiples ediciones de baseampliando la aplicabilidad de las herramientas a enfermedades genéticas caracterizadas por mutaciones múltiples.
La edición de bases y primos son técnicas de edición del genoma que permiten modificaciones precisas y específicas de las secuencias de ADN sin introducir rupturas de doble cadena, lo que mejora el potencial para tratar trastornos genéticos con efectos mínimos fuera del objetivo.
La edición primaria, un recién llegado al espacio de la edición genética, utiliza una proteína Cas modificada y un ARN guía para reclutar una transcriptasa inversa a una secuencia específica en la cadena de ADN objetivo.
Aunque las primeras iteraciones del editor se centraban en inserciones o deleciones cortas (de decenas de pares de bases), los científicos ahora están explorando sistemas para integraciones y deleciones del tamaño de un gen para una edición genética de precisión. La edición de primera está apareciendo en todas las ciencias de la vida, incluidas bibliotecas de alto rendimiento para estudiar la genética del cáncer y nuevos sistemas para Seguimiento de la expresión genética en las células.
Explora más a fondo la edición principal en Este artículo.
Los editores de base y de primer nivel aún conllevan riesgos
Los investigadores del Instituto Científico San Raffaele descubrieron que, si bien la edición de bases y de genes principales reducía las mutaciones no deseadas en comparación con CRISPR-Cas9, aún generaba algunas mutaciones, en particular en los sitios de corte. Por ejemplo, el equipo detectó mutaciones que sugieren que estos nuevos editores aún pueden inducir roturas accidentales de la doble cadena de ADN y producir subproductos genotóxicos, como deleciones o translocaciones adicionales. Además, los ARN guía más largos utilizados en los editores de bases pueden desencadenar respuestas inmunitarias. El análisis de riesgo-beneficio de las herramientas de edición genómica realizado por los investigadores destaca la necesidad de una optimización continua de los perfiles de seguridad de estas tecnologías antes de su aplicación clínica generalizada.
Descubra información adicional sobre los riesgos de las herramientas de edición genética en Esta historia.
Evaluación de la seguridad de las tecnologías basadas en CRISPR
En lugar de utilizar tecnologías basadas en CRISPR para editar animales de laboratorio o células humanas en una placa, Kevin Esveltun biólogo del Instituto Tecnológico de Massachusetts, está llevando la tecnología a la naturaleza para alterar la trayectoria de la evolución. Para introducir de forma fácil y estable un rasgo deseado en organismos silvestres, como por ejemplo manipular los genes del mosquito para eliminar la malaria y garantizar que el gen editado se transmita a toda la descendencia, Esvelt desarrolló un sistema de impulsión genética CRISPR. Sin embargo, Esvelt se dio cuenta rápidamente del inmenso poder y los peligros potenciales de dicha tecnología, ya que podría utilizarse indebidamente para causar daño, como por ejemplo editar el genoma del mosquito para introducir una nueva enfermedad. A pesar de estas preocupaciones, cree que la tecnología favorece la defensa y aboga por su uso responsable, haciendo hincapié en la necesidad de la confianza pública para garantizar su aplicación ética.
Esvelt utiliza un trozo de tela blanca para recoger garrapatas como parte del proyecto Ratones Contra Garrapatas.
Día de Jimmy
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Las tecnologías basadas en CRISPR siguen avanzando en la edición genética, pero aún enfrentan muchos desafíos, como la reducción de los efectos no deseados y las respuestas inmunitarias adversas. Además de los esfuerzos en curso para mejorar la precisión de la edición genética, los investigadores están mejorando la sistemas de entrega utilizado para terapias genéticas CRISPR y explorar nuevas aplicaciones de investigación para estas tecnologías, incluyendo Plataformas de detección de células T con CAR y agricultura molecular.