incógnitaiaokang lunactualmente biólogo de sistemas en la Universidad de Harvard, utilizó la citometría de masas en su investigación de posgrado para estudiar la señalización intracelular. Sin embargo, si bien este método puede consultar hasta 50 proteínas únicas con una superposición limitada utilizando anticuerpos etiquetados con metales, requiere una alta producción de señales para la detección, lo que complica el estudio de proteínas de baja abundancia. Como investigador postdoctoral en el laboratorio de Peng Yin, Lun y sus colegas desarrollaron un nuevo enfoque utilizando moléculas de ADN para mejorar la señal de estos objetivos. La técnica, amplificación por extensión cíclica (ACE), es adecuado para análisis de citometría de masas in vitro, así como para estudios de citometría de masas por imágenes (IMC).1
¿Qué te motivó a desarrollar la técnica ACE?
Una de las limitaciones de la citometría de masas es su baja sensibilidad. Para alcanzar el límite de detección, el objetivo necesita múltiples copias de la etiqueta del anticuerpo unida, lo que dificulta el estudio de objetivos de baja abundancia, ya sean proteínas completas o sitios de modificación postraduccional (PTM). Nuestro grupo desarrolló previamente un método diferente para amplificar estas señales de células y tejidos in situ, pero no fue eficaz para muestras de citometría de masas in vitro.2
¿Qué sucede en este enfoque?
A diferencia de la citometría de masas tradicional, donde la etiqueta metálica se une directamente al anticuerpo que se unirá al objetivo, agregamos polímeros de ADN cortos al anticuerpo que se extienden a lo largo de una serie de pasos de amplificación. Unimos un polímero detector conjugado con metal a una cadena de oligonucleótidos que reconocía estas secuencias extensoras para etiquetar estos polímeros de ADN amplificados. Este proceso amplificó la señal objetivo específica más de 500 veces.
Los extensores de ADN unidos al anticuerpo específico del objetivo proporcionan más sitios de unión para el detector final, por lo que esto supera el problema de señal de fondo de los objetivos de baja abundancia. Esto no sólo podría ayudar a identificar objetivos de baja abundancia, como PTM, a nivel unicelular, sino que también puede extender la citometría masiva al estudio de células más pequeñas que los métodos tradicionales no podían detectar. También demostramos que ACE se puede aplicar a IMC y supera la señal de anticuerpos limitada que ocurre con IMC tradicional y al mismo tiempo ofrece las ventajas de la citometría de masas que evita la autofluorescencia en la microscopía de fluorescencia estándar.
Para aumentar la detección de señales de proteínas de baja abundancia mediante citometría de masas, los investigadores desarrollaron un método llamado amplificación por extensión cíclica (ACE). Unieron secuencias únicas de oligonucleótidos de ADN a anticuerpos específicos del objetivo, incubaron la muestra con los anticuerpos unidos al ADN y eliminaron las proteínas no unidas con lavado (1). Utilizando un oligonucleótido que contiene dos secuencias consecutivas complementarias a las de los anticuerpos unidos al ADN y una polimerasa, los investigadores realizaron múltiples rondas de amplificación para extender la cadena de ADN unida al anticuerpo (2). Después de la amplificación, los investigadores agregaron oligonucleótidos detectores unidos a un ion metálico. Las secuencias de estos detectores eran complementarias a las de los anticuerpos unidos al ADN. El detector también contenía un ácido nucleico que se entrecruza con una base adyacente opuesta cuando se expone a la luz ultravioleta (3). La etiqueta de anticuerpo de ADN amplificado unida a iones metálicos proporcionó una señal mejorada tanto para muestras de citometría de masas suspendidas como para imágenes de citometría de masas (4).
Imran Chowdhury, adaptado de Lun X, et al.
¿Cuáles fueron algunos de los desafíos en el desarrollo de ACE?
Un desafío fue evitar que las extensiones de ADN se desnaturalizaran durante un paso de calentamiento a 200 grados Celsius para vaporizar las muestras. Incorporamos un paso de reticulación y eso mejoró la estabilidad del ADN en este paso. Además, encontramos un problema en el paso de introducción de la muestra. Esto resultó ser porque el tubo del instrumento estaba hecho de sílice, que se une al ADN. Reemplazar este tubo con plástico que no une ADN resolvió este problema.
¿Cuáles son algunas direcciones futuras para esta técnica en su laboratorio?
Un proyecto futuro en el laboratorio es simplificar el protocolo de conjugación de anticuerpos que utilizamos actualmente para que sea más accesible. También estamos interesados en aplicar esta amplificación de señal a otros métodos, como los ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA) y las transferencias Western.
Divulgación de conflictos de intereses: Xiaokang Lun, Peng Yin y otro coautor del estudio solicitaron una patente relacionada con el método ACE.