BLas conferencias de iología enseñan a los estudiantes que cuando la maquinaria de replicación de una célula se une, la ADN polimerasa despega por la doble hélice como un automóvil en una carretera, replicando continuamente la cadena. Si se comete un error, la misma enzima detiene, revierte y corrige el error, luego regresa a su incesante viaje hasta el final de la línea.

Sin embargo, investigación publicada En los últimos 10 a 15 años cada vez más desafiado ese modelo, lo que sugiere que la replicación y corrección del ADN involucra múltiples polimerasas.^1,2 Ahora, en una publicación en comunicaciones de la naturaleza, un equipo de la Universidad Vrije de Ámsterdam proporcionó pruebas adicionales de que ADN polimerasa no replica el ADN tan continuamente como se creía.³

«A diferencia de esas proteínas que se encuentran en el ADN unidas de manera muy estable, van y vienen todo el tiempo», dijo Antoine van Oijenbiofísico molecular de la Universidad de Sydney que no participó en el trabajo. «Es casi como si estuvieras cambiando neumáticos mientras conduces». Desentrañar la actividad de la ADN polimerasa puede ayudar a los científicos a comprender mejor la replicación y reparación del ADN y explorar cómo estos procesos fallan y conducen a enfermedades como el cáncer.

“Este hallazgo [happened] por casualidad”, dijo Long Fu Xubiofísico e investigador postdoctoral en Gijs WuiteLaboratorio de la Universidad Vrije de Ámsterdam. Inicialmente, el equipo se propuso estudiar otra proteína de la maquinaria de replicación, la proteína de unión al ADN monocatenaria, y su interacción con la ADN polimerasa. Sin embargo, primero necesitaban establecer cómo las dos proteínas interactuaban con el ADN de forma independiente. Mientras exploraba la actividad de la ADN polimerasa, el equipo observó algo inesperado: las proteínas saltaban rápidamente dentro y fuera del ácido nucleico.

Para determinar dónde estaba la ADN polimerasa y qué estaba haciendo, Xu y sus colegas combinaron dos métodos: microscopía confocal y pinzas ópticas. El equipo estiró una hebra de ADN de 8.000 kilobases entre dos cuentas fijadas con láser. La cadena de ADN atada estaba compuesta por un segmento bicatenario (ADNbc) que se convirtió en monocatenario (ADNss). Utilizando láseres, aplicaron diferentes cantidades de fuerza para imitar la tensión que el ADN normalmente experimenta durante la replicación o corrección para promover experimentalmente estas funciones enzimáticas. Luego, al agregar una etiqueta fluorescente a la ADN polimerasa, rastrearon el progreso de la enzima y la dinámica de unión al ADN.

“Podemos aplicar tensiones en el ADN y también podemos visualizar los movimientos de la polimerasa en el ADN, pero estos dos conjuntos de datos son independientes. Queríamos correlacionarlos”, dijo Xu. Sin embargo, explicó que sincronizar estos dos conjuntos de datos y mapear el camino de la proteína a lo largo de la cadena planteaba desafíos. Sin embargo, al rastrear la unión de proteínas fluorescentes en la unión dsDNA-ssDNA, el equipo pudo superponer estas dos piezas de información para revelar el comportamiento de la ADN polimerasa.

Los investigadores observaron que, en promedio, una sola molécula de ADN polimerasa permanecía unida al ácido nucleico en la unión durante poco más de un segundo, lejos de la unión continua que describen la mayoría de los libros de texto. Para contrastar aún más con el dogma, durante este tiempo, una única enzima solo realizaba extensión o corrección, y ocasionalmente también hacía una pausa en el ADN; en lugar de retroceder para corregir un error, la enzima se separó del ácido nucleico para permitir que otro se uniera.

«La idea de tener un motor que se pone en marcha atrás nos parece muy atractiva, pero es mucho más eficiente tirar el motor», explicó Wuite. A diferencia de los automóviles, una célula tiene múltiples motores de ADN polimerasa, por lo que una enzima que ya está en la configuración necesaria para unir el ADN y corregir el error puede tomar el control. Este intercambio requiere menos energía que la misma proteína cambiando de conformación para cumplir una función diferente.

Sin embargo, la actividad de la ADN polimerasa parecía fluida y uniforme, por lo que el equipo consideró que existía un proceso para ayudar a una enzima a continuar donde lo dejó otra, actuando como un recuerdo. Analizaron un evento de extensión y observaron que las polimerasas se liberaban y rebotaban varias veces, pero cada vez reanudaban la misma función.

Para estudiar esto más a fondo, el equipo evaluó el estado de actividad (enzimática o en pausa) antes, durante y después de que una polimerasa fluorescente se uniera al ADN en el transcurso de varios experimentos. Descubrieron que el patrón más común era que la actividad fuera la misma en los tres puntos de observación, ya sea que el período enzimático fuera durante la reparación de la exonucleasa o la extensión del ADN.

«Este experimento es realmente el clavo en el ataúd de este modelo en el que todo se asienta de manera estable en el ADN», dijo van Oijen. Añadió que los estudios estructurales serán importantes para agregar contexto adicional a estos mecanismos.

«El verdadero sueño es, por supuesto, ver todos esos componentes diferentes al mismo tiempo, trabajando en la unión donde se encuentran el ADN monocatenario y el bicatenario», dijo Wuite. Xu y sus colegas comenzaron a trabajar en estos experimentos.

Los investigadores también están aplicando este enfoque dual a otras cuestiones, como el estudio de la segregación cromosómica. «Lo que se lee en los libros de biología sobre la organización de los cromosomas es en gran medida una fantasía», dijo Wuite. «Con nuestras herramientas, podemos dar algunos pasos hacia adelante y luego, al comprender cómo están realmente organizadas, entendemos algunas de las cosas básicas que van bien o mal».

Divulgación de conflictos de intereses: Gijs Wuite es cofundador y accionista de LUMICKS, una empresa de instrumentos de investigación biológica, y posee patentes relacionadas con la metodos y tecnologías descrito en esta historia.