PAGLa secuenciación de proteínas presenta desafíos diferentes a los de la secuenciación de ácidos nucleicos, lo que significa que la proteómica aún no se ha beneficiado tanto como la genómica de la revolución de la secuenciación de próxima generación. Sin embargo, la capacidad de secuenciar proteínas a niveles de ácidos nucleicos sería tremendamente beneficiosa. En consecuencia, los científicos buscan secuenciación de ácidos nucleicos de alto rendimiento para inspirarse sobre cómo mejorar las técnicas de secuenciación de proteínas existentes o desarrollar otras nuevas.1
Jeff Nivala utiliza nanoporos para leer proteínas con sensibilidad a un solo aminoácido.
Jeff Hagen
Jeff Nivalaingeniero molecular de la Universidad de Washington, considera que la tecnología de nanoporos es el camino a seguir hacia la secuenciación de proteínas de moléculas individuales y más allá. En esta entrevista, Nivala describe su Nueva técnicadonde utiliza la enzima ClpX para desplegar y hacer girar largas cadenas de proteínas a través de nanoporos, lo que permite leerlas con la sensibilidad de un solo aminoácido. 2
¿Qué despertó su interés en utilizar la tecnología de nanoporos para la secuenciación de proteínas?
El gran avance en la secuenciación de ácidos nucleicos mediante nanoporos fue el descubrimiento de una proteína motora que puede hacer avanzar la cadena nucleótido por nucleótido a través del poro. Al comienzo de mis estudios de posgrado, traté de encontrar un motor similar para proteínas. Afortunadamente, casi al mismo tiempo, Un estudio salió en Celúla que caracterizaba cómo funcionaba la desfoldasa ClpX a nivel de molécula única.3 Los detalles presentados en este estudio me permitieron imaginar cómo podría transferir esta proteína motora y aplicarla para la secuenciación de proteínas de nanoporos, y pude sacar conclusiones.4
¿Cuál es la mayor diferencia entre el uso de la tecnología de nanoporos para la secuenciación de proteínas y la secuenciación de ácidos nucleicos?
La secuenciación de proteínas es mucho más complicada. Los ácidos nucleicos tienen cadenas principales uniformes con carga negativa, lo que significa que la fuerza electroforética es suficiente para mover los ácidos nucleicos a través de un nanoporo. Las proteínas tienen carga heterogénea, por lo que no se comportan tan bien y las señales se vuelven más ruidosas. También hay mucha más complejidad cuando se trabaja con 20 aminoácidos en comparación con cuatro nucleótidos, por no hablar de las estructuras terciarias, los dominios plegados, etc.
¿Qué tan difícil es hacer pasar una proteína a través de un nanoporo?
ClpX puede manejar proteínas sintéticas con bastante facilidad porque no están plegadas. Las proteínas naturales con dominios completamente plegados pueden ser más difíciles de resolver porque deben desplegarse antes de pasar a través del nanoporo. Las proteínas también pueden volver a plegarse en el lado trans del poro después de pasar a través de él. En otro estudio que utilizó esta tecnología, en realidad tenemos que desplegar una proteína dos veces: una antes de que pueda pasar a través del nanoporo mediante fuerza electroforética y otra antes de que pueda volver a subir. Todavía queda mucho por descubrir sobre cómo funciona un motor con una proteína determinada.
¿Qué tan difícil es distinguir entre diferentes aminoácidos?
La señal que observamos proviene de la detección de una ventana deslizante de alrededor de 20 aminoácidos a la vez a medida que pasan a través del poro. Esto hace que sea mucho más difícil detectar diferencias de aminoácidos individuales. Sin embargo, cuanto más larga sea la secuencia, mayores serán las probabilidades de que genere elementos de señal distintos. Al juntar estos elementos individuales se crea una firma colectiva única, que nos permite adoptar un enfoque basado en huellas dactilares y usar una firma para identificar una proteína.
Estas diferencias de secuencia pueden ser muy sutiles, lo que dificulta la realización de estadísticas tradicionales u otros métodos de análisis. Aquí es donde entra en juego el aprendizaje automático. Estamos entrenando programas de aprendizaje automático para extraer las diferencias en la señal entre diferentes proteínas, aprender qué características están asociadas con qué aminoácidos y mapear cómo los aminoácidos circundantes contribuyen a la señal observada en una posición determinada.
¿Cuáles son sus objetivos a corto y largo plazo para esta técnica?
Estamos aumentando el tamaño de nuestros conjuntos de datos analizando secuencias de aminoácidos más complejas para poder entrenar mejores modelos. La mayoría de nuestros datos actuales provienen de proteínas sintéticas, por lo que estamos ampliando nuestro conjunto de datos añadiendo más moléculas naturales. En última instancia, el objetivo es tener un modelo que pueda reconocer cualquier proteína arbitraria del proteoma humano.
A medida que avanzamos por ese camino, prevemos que veremos aparecer nuevos desafíos. Por ejemplo, ¿necesitaremos una proteína motora mejorada para ciertos tipos de secuencias de proteínas? ¿Un tamaño de poro diferente hará que nuestro método sea más sensible porque nuestro nanoporo actual fue optimizado para secuencias de ADN? Habrá muchas mejoras que harán que esta técnica sea exponencialmente mejor en el futuro.
Esta entrevista ha sido condensada y editada para mayor claridad.