La apreciación de la complejidad de los tejidos en trastornos como el cáncer ha llevado a los investigadores a desarrollar métodos de inmunohistoquímica múltiple (mIHC), en los que se analizan docenas de marcadores en un solo portaobjetos. Estos métodos brindan información sobre los estados patológicos al resaltar la arquitectura del tejido a nivel unicelular dentro del contexto espacial.

dermatopatólogo Francesca Bosisio y bioingeniero Frederik De Smet son copresidentes de las instalaciones de KU Leuven para mIHC. Su tecnología insignia mIHC de alta plexidad, etiquetado iterativo múltiple por neodeposición de anticuerpos (MILÁN), es un método de tinción cíclico que utiliza anticuerpos fluorescentes convencionales para teñir hasta 80 marcadores en el mismo portaobjetos.¹ En sus instalaciones, ofrecen servicios mIHC de extremo a extremo para científicos de KU Leuven y más allá. En esta entrevista con El científico, Bosisio y De Smet analizan el origen de MILAN y los beneficios de mIHC.

¿Cómo se desarrolló el método MILAN?

Francesca Bosisio: Cuando era médico residente en la Universidad de Milano-Bicocca. Estaba trabajando con Giorgio Cattoretti y pensamos que era hora de tener más de diez marcadores en un portaobjetos de patología. Para desarrollar un protocolo mIHC, comenzamos a comparar diferentes métodos de eliminación de anticuerpos. Dedicamos bastante tiempo a desarrollar una solución de extracción eficiente que fuera suave con el tejido.

Luego vine a KU Leuven para realizar estudios de posgrado y el método de tinción estaba listo para ser probado. Tenía un panel de 39 marcadores fenotípicos y funcionales para investigar el microambiente en los tejidos del melanoma primario. De repente, tenía una gran cantidad de imágenes multiplexadas sin forma de analizarlas. Nos llevó dos años desarrollar nuestro propio proceso desde cero, pasar de las señales de células individuales a hacer inferencias sobre las relaciones celulares en el tejido. Eso nos llevó a desarrollar nuestro propio software de análisis y a comprender cómo Estado de activación de los cambios de los linfocitos T en diferentes regiones de los melanomas primarios.²

¿Cómo se compara MILAN con otros métodos mIHC de alta plexidad?

Frederik De Smet: La mayoría de las demás tecnologías se limitan a un área de un centímetro o menos que se puede teñir. Con MILAN analizamos toda la superficie de un portaobjetos de histología normal.

PENSIÓN COMPLETA: No utilizamos anticuerpos diseñados; Podemos utilizar cualquier anticuerpo de interés para el proyecto después de haberlo validado. Si un investigador ha desarrollado su propio anticuerpo, podemos implementarlo inmediatamente. Además, MILAN utiliza anticuerpos secundarios para amplificar las señales. Esto permite la captura de señales de menor intensidad, por lo que el rango de expresión de una proteína que se puede detectar es más amplio que cuando se usan anticuerpos primarios sin un sistema de amplificación.

¿Cómo optimiza su instalación el método MILAN?

FDS: Seleccionamos todo el proceso de principio a fin. Cuando los investigadores traen sus muestras a nuestras instalaciones, contamos con patólogos involucrados. Es un desafío integrar los datos espaciales y de una sola celda. Es importante contar con alguien con años de conocimiento y capacitación que observe los tejidos teñidos. Los patólogos pueden determinar si ciertas señales son relevantes antes de que un investigador profundice en las interacciones que identificaron.

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Además, contamos con instrumentación interna que puede realizar gran parte del trabajo automáticamente, lo que resulta beneficioso para la estandarización y la calidad de los datos. El análisis de datos suele ser un desafío, por lo que estamos trabajando en una solución en la que alguien sin habilidades bioinformáticas pueda comprender los niveles de expresión que están presentes en diferentes fenotipos.

Ambos son investigadores del cáncer. ¿Cómo beneficia mIHC a este campo?

PENSIÓN COMPLETA: El cáncer tiene un ecosistema inmunológico complejo. Hay diferentes tipos de células inflamatorias que combaten el tumor, y el tumor en sí es heterogéneo y asume diferentes estados celulares. Para caracterizar cada célula del portaobjetos, los investigadores deben teñir marcadores específicos en cada una de estas células cancerosas. De esta manera podemos mostrar un panorama complejo para cada paciente en términos de su cáncer específico y la composición de la población inflamatoria. Si podemos ver la heterogeneidad específica del paciente, podemos encontrar un medicamento mejor que aborde el cáncer particular del paciente.

En un estudio reciente, mapeamos el fenotipos inmunes de pacientes con melanoma antes de recibir inmunoterapia.³ El componente espacial de mIHC es lo que marcó la diferencia en nuestros resultados. Para determinar si un paciente respondería a la inmunoterapia, era importante ver la expresión de marcadores en ciertos tipos de células que estaban ubicadas en una parte específica del tumor.

FDS: Para el glioblastoma, los enfoques de inmunoterapia disponibles actualmente no están funcionando bien. Para explorar nuevas estrategias, necesitamos saber dónde se encuentran determinadas células, cómo interactúan y la arquitectura del tejido. Estamos utilizando tecnologías multiplex para comprender un espectro de perfiles de pacientes y determinar cómo podríamos intervenir de forma personalizada.

¿Qué hay en el horizonte para el método MILAN?

FDS: La siguiente etapa es combinar MILAN con otras tecnologías, como realizar mIHC y superponer transcriptómica sobre células individuales en el mismo portaobjetos. Esto añade otro nivel de complejidad y comprensión de los procesos patológicos que no sería posible con estos métodos por sí solos. Ese es el objetivo final.

Esta entrevista ha sido condensada y editada para mayor claridad.

Referencias

1. Bolognesi MM, et al. Tinción múltiple mediante inmunotinción secuencial y eliminación de anticuerpos en secciones de tejido de rutina. J Histochem Citochem. 2017;65(8):431-444.
2. Bosisio FM, et al. Heterogeneidad funcional de patrones linfocíticos en melanoma primario disecado mediante multiplexación unicelular. eVida. 2020;9:e53008.
3. Antoranz A, et al. El mapeo del panorama inmunológico en el melanoma metastásico revela interacciones célula-célula localizadas que predicen la respuesta a la inmunoterapia. Cáncer Res. 2022;82(18):3275-3290.