FLa citometría baja es una técnica analítica ampliamente utilizada que distingue entre poblaciones celulares en función de la presencia o ausencia de marcadores elegidos. Sin embargo, la cantidad de marcadores que se pueden incluir en un panel de citometría de flujo está limitada por la cantidad de fluoróforos con espectros de emisión distinguibles. La citometría de flujo espectral, una versión evolucionada de la citometría de flujo convencional, supera este problema al diferenciar entre fluoróforos que emiten de manera similar, aumentando así el tamaño de los paneles.
Kaitlyn Sadtler, investigador de Earl Stadtman y jefe de la Sección de Inmunoingeniería del Instituto Nacional de Imágenes Biomédicas y Bioingeniería (NIBIB), estudia la respuesta inmune al trauma tisular y la implantación de dispositivos médicos. En un artículo publicado recientemente Órganos de tejido celular En el artículo, el laboratorio de Sadtler desarrolló un panel de citometría de flujo espectral de 24 colores para investigar la infiltración de células inmunes en el sitio de lesión muscular en ratas.1
Kaitlyn Sadtler utiliza citometría de flujo espectral para evaluar la respuesta inmune a la lesión tisular.
NIBIB/Chia-Chi “Charlie” Chang
En una entrevista con El científicoSadtler analizó por qué y cómo desarrolló su panel de citometría de flujo espectral para ratas, así como las ventajas y desventajas de la citometría de flujo espectral.
¿Qué es la citometría de flujo y la citometría de flujo espectral?
La citometría de flujo mide la expresión de diferentes proteínas en las células, una a la vez, mientras fluyen a través de una máquina. Puedes pensar en ello como canicas a través de una manguera de jardín. A medida que pasa cada canica, hay detectores que dicen: “esta canica tiene naranja” o “esta canica tiene violeta”. Esos colores diferentes representan las emisiones máximas de los fluoróforos y esto nos dice qué proteínas están presentes en las células.
Todo en la vida y la ciencia es un caos. Algunos fluoróforos emiten en una variedad de longitudes de onda, por lo que algunas canicas tienen un color rojo anaranjado en su interior en lugar de solo naranja o rojo. La citometría de flujo espectral es una versión de la citometría de flujo, que en lugar de observar un pico en un canal específico (es decir, el canal naranja o el canal rojo), observa el patrón de todo el espectro. Esta técnica permite a los investigadores separar señales de fluoróforos de colores muy similares.
¿Por qué generaste un panel de citometría de flujo espectral para ratas?
Trabajamos en la intersección de la inmunología y la bioingeniería, donde cada campo tiene un sistema modelo diferente. Los ratones han sido el caballo de batalla de la inmunología durante mucho tiempo y, como resultado, existe una gran cantidad de reactivos. Sin embargo, los investigadores utilizan ratas con más frecuencia al evaluar dispositivos médicos y biomateriales, pero la disponibilidad de reactivos es limitada. Queríamos cerrar la brecha entre los estudios de inmunología mecanicista básica que se realizan en modelos de ratón y los estudios de biomateriales que se realizan en modelos de rata. Nuestro objetivo era descubrir qué herramientas existen para las ratas, ensamblarlas en una caja de herramientas utilizable y presentar dicha caja de herramientas. El citómetro de flujo espectral nos permitió utilizar fluoróforos de colores similares que no necesariamente podían usarse juntos en un citómetro de flujo estándar.
¿Cómo construyó su panel para citometría de flujo espectral?
Para construir nuestro panel, Kenneth Adusei, el autor principal del artículo, y yo realizamos una búsqueda de productos de los diversos anticuerpos de rata que estaban disponibles en el mercado. Creamos una hoja de cálculo de reactivos que indicaba qué proveedores tenían qué anticuerpos y en qué colores. En cuanto a elegir qué fluoróforos usar, necesitábamos evaluar la autofluorescencia de nuestras muestras para evitar los canales máximos por donde entraba la autofluorescencia.
¿Cuáles son las ventajas y desventajas de la citometría de flujo espectral?
La citometría de flujo espectral permite a los científicos distinguir entre la señal real de un fluoróforo y la señal que podría transmitirse desde un fluoróforo superpuesto. Esto permite a los investigadores medir más colores a la vez con confianza. Obtienen más información que desean, pero también ruido de la autofluorescencia. Trabajamos con muestras altamente autofluorescentes, y parte de esta autofluorescencia proviene de las propias células mieloides, que brillan con bonitos colores antes de teñirlas. Esto nos da una variable adicional con la que lidiar. Pero la autofluorescencia también proporciona mucha información. Por ejemplo, podemos identificar los eosinófilos únicamente por su autofluorescencia, sin ningún marcador. Esto apunta al reconocimiento futuro de diferentes poblaciones de células basándose en su autofluorescencia. Aunque el ruido adicional es molesto, ese ruido contiene información. Sólo tenemos que leer la señal.
Esta entrevista ha sido condensada y editada para mayor claridad.
Referencias
- Adusei KM, et al. Desarrollo de un panel de citometría de flujo de alto color para el análisis inmunológico de lesiones tisulares y reconstrucción en un modelo de rata. Células Tejidos Órganos. 2023;212(1):84-95.