Edición de genes CRISPR: Cas9 y más allá

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CRISPR, acrónimo de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente espaciadases una familia de genes que evolucionaron por primera vez en organismos procarióticos como bacterias y arqueas para defenderse contra fagos infecciosos.¹ De manera análoga a la memoria inmune adaptativa eucariota, las secuencias CRISPR derivan de bacteriófagos que previamente infectaron a procariotas; Las bacterias utilizan sus secuencias CRISPR y nucleasas llamadas Asociado a CRISPR (Cas) proteínas para detectar y destruir bacteriófagos familiares.¹ Hoy en día, los investigadores se basan en los mecanismos de los sistemas CRISPR procarióticos para diseñar sistemas mediados por CRISPR-Cas. tecnologías de edición de genesque utilizan proteínas Cas y ARN guía para bloquear, cortar o editar genes diana.¹

Cómo funciona la edición genética

Originario de la bacteria Streptococcus pyogenes, cas9 fue la primera proteína Cas que los científicos reutilizaron para la edición de genes.¹ La tecnología CRISPR-Cas9 utiliza un ARN guía único (ARNsg) para apuntar y escindir el ADN. Los investigadores diseñan objetivos específicos sgRNA combinando dos moléculas de ARN del sistema CRISPR bacteriano: una secuencia que reconoce una ubicación específica en el ADN (crRNA) y una secuencia que actúa como andamio de unión para Cas9 (tracrRNA).¹ La secuencia modificable de sgRNA permite a los científicos programa un sistema CRISPR-Cas9 para apuntar a cualquier secuencia de ADN de interés si está cerca de una secuencia de ADN específica de Cas llamada motivo adyacente al protoespaciador (PAM).^1,2 El PAM inicia la unión del ADN-Cas9, el ARNsg invade la doble hélice y se hibrida con el ADN objetivo, y Cas9 rompe el ADN objetivo bicatenario desenrollado inmediatamente delante del PAM. Mecanismos de reparación, a saber reparación dirigida por homología (HDR) y Unión de extremos no homólogos (NHEJ)reparar la rotura, que puede alterar la función biológica del gen objetivo.³

Por ejemplo, los investigadores pueden utilizar los diferentes mecanismos de reparación a su favor para insertar intencionalmente un cambio de secuencia deseado a través de HDR dependiente de plantilla o introducir cambios aleatorios a través de NHEJ independiente de plantilla. Si los científicos dotan a la maquinaria de reparación celular de un gen diana plantilla que contiene una mutación, como una relevante para la enfermedad mutación, el proceso HDR incorporará la mutación moldeada en el genoma después de la escisión de Cas9.^1,2 Por el contrario, la vía NHEJ, más propensa a errores, repara el corte de Cas9 sin una plantilla mediante la introducción de inserciones y eliminaciones aleatorias (indeles) que en última instancia alteran la expresión genética o conducen a pérdida de función.^1,2 Cualquiera de estos enfoques permite a los investigadores investigar cómo el silenciamiento o la edición de un gen específico afecta su evolución. caminos.¹

Superar las limitaciones de CRISPR

Los investigadores a menudo luchan con Cas9 cortando el ADN en lugares fuera del objetivo, lo que puede conducir a translocacionesgrandes eliminaciones inesperadas y cambios no deseados en la expresión genética.⁴ Para evitar estos efectos secundarios no deseados, los investigadores diseñan alternativas a Cas9.⁵

Tabla 1. Descripción general de Cas9 y alternativas comunes a Cas9^5-7

Cas12a

Cas12a ofrece múltiples ventajas sobre Cas9 (Tabla 1).⁸ Produce escalonado en lugar de roturas contundentes del ADN,⁹ cual favorecer HDR mecanismos en lugar de NHEJ y HDR.⁵ Además, Cas12a no necesita un ARNtracr y posee actividad RNasa que puede procesar una única matriz de pre-ARNcr que contiene varios ARN guía para una edición multigénica más sencilla que Cas9.¹⁰ Cas12a también ha reducido efectos fuera del objetivo en comparación con Cas9,¹¹ y es excepcionalmente capaz de ser independiente de PAM degradación del ADN monocatenarioque es útil para diagnóstico aplicaciones.^5,12

cas 13

Cas13 Se diferencia de Cas9 y Cas12a en que escinde ARN monocatenario en lugar de ADN. Trabajando con su secuencia guía, se dirige al ARN de las células eucariotas para su degradación con alta eficiencia. Este es un enfoque prometedor para la ingeniería del transcriptoma, ya que modula la expresión genética sin alterar la secuencia del ADN.¹³

Modificaciones del genoma con edición base o principal

Los editores base y los editores principales son tecnologías basadas en CRISPR de nueva generación que se basan en proteínas Cas catalíticamente deterioradas llamadas nickasque los investigadores fusionan con otras enzimas que modifican el ADN.² Debido a que las Cas nickasas son menos activas que las nucleasas Cas tradicionales, introducen roturas (o mellas) en el ADN monocatenario en lugar de roturas bicatenarias. Estos nicks no suelen reclutar Maquinaria de reparación de ADN.que permite que las enzimas de fusión actúen sobre el ADN con mayor precisión de edición que los métodos mediados por reparación.²

¿Qué es la edición básica?

Edición básica utiliza versiones modificadas de proteínas Cas que cortan el ADN y que conservan sus capacidades de unión al ADN sin introducir roturas de doble cadena.¹⁴ Estos catalíticamente deteriorado Las proteínas Cas guían una enzima adenina o citidina desaminasa a un sitio específico en el ADN, donde provocan conversiones de CG a TA o de AT a GC.¹⁵ En teoría, la edición básica puede corregir cualquier mutación de transición (A a G, o C a T),^dieciséis que representan aproximadamente 30 por ciento de alelos de enfermedades conocidas y son la clase más grande de enfermedades humanas que causan mutaciones.¹⁴

¿Qué es la edición principal?

Para edición principaluna proteína Cas con nucleasa alterada recluta una transcriptasa inversa en la secuencia de ADN deseada sin introducir roturas de doble cadena.¹⁷ Una transcriptasa inversa convierte el ARN en ADN. En el contexto de la edición principal, la transcriptasa inversa reemplaza o inserta una secuencia de ADN codificada por un ARN guía del editor principal (ARNpeg).¹⁷ Estos editores principales altamente versátiles no se limitan al emparejamiento específico de editores base y pueden catalizar el cambio entre cualquier base. También pueden generar inserciones de hasta 44 pares de bases (bps) y eliminaciones de hasta 80 bps.¹⁸

Edición de transcriptomas con modulación CRISPR y dCas

CRISPR modulación cambia la expresión genética sin introducir cambios en la secuencia del ADN.¹⁹ Los científicos fusionan una nucleasa Cas catalíticamente inactiva (Cas muerta o dCas) con un dominio represor para Interferencia CRISPR (CRISPRi) o con un dominio de activación transcripcional para Activación CRISPR (CRISPRa).¹⁹ La proteína de fusión dCas se une a la secuencia diana del ADN sin introducir roturas de doble cadena, recluta pequeños ARN reguladores para el locus y provoca la eliminación de la expresión génica (CRISPRi a través del dominio represor) o activación de la expresión genética (CRISPRa).²⁰

Nuevas aplicaciones de la tecnología CRISPR

La edición de bases tiene un poderoso potencial médico debido a su bajo riesgo de crear inserciones y eliminaciones. Se ha combinado con la terapia con células CAR-T en ensayos clínicos para tratar otros casos. casos de leucemia intratables.²¹

Porque la edición principal puede corregir la mayoría de las mutacionesexcluyendo grandes duplicaciones, eliminaciones, inserciones o reordenamientos cromosómicos, los investigadores están investigando su capacidad para tratar una variedad de trastornos, que van desde enfermedades hereditarias hasta el cáncer.²²

Finalmente, las aplicaciones preclínicas CRISPRi y CRISPRa permiten a los investigadores realizar pantallas grandes del redes genéticas enfermedades subyacentes de etiología desconocida, como trastornos neurodegenerativos.^23,24

Referencias

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