CLa señalización del calcio es parte integral del funcionamiento adecuado de las neuronas. Las mutaciones que alteran este proceso causan una variedad de trastornos neurológicos. En el síndrome de Timothy (TS), una mutación puntual en el gen Subunidad de canal dependiente de voltaje de calcio Alpha1 C (CACNA1C) retrasa el cierre de los canales de calcio, aumentando el calcio intracelular, lo que en consecuencia mejora la activación neuronal. La mutación también dificulta la migración de las neuronas durante el desarrollo y perjudica sus proyecciones dendríticas.
En un estudio publicado en Naturaleza, Sergiu Paşcaneurocientífico de la Universidad de Stanford, investigó los oligonucleótidos antisentido como una intervención para esto CACNA1C mutación del exón y demostró que el tratamiento restauró la función del canal CACNA1C.1 Estos hallazgos allanaron el camino para llevar este enfoque a ensayos clínicos como una posible terapia contra el ST.
“Durante los últimos 15 años, hemos ido entendiendo cada vez mejor esta enfermedad”, dijo Paşca. Recientemente, él y su equipo desarrollaron neuronas modelos de células madre y tridimensional organoides cerebrales de las neuronas de pacientes con ST para explorar esta biología.2,3
“De repente, al utilizar estos modelos de células madre humanas, tuvimos suficiente información sobre la biología de la enfermedad, por lo que una oportunidad terapéutica se convirtió en una posibilidad”, dijo.
El grupo de Paşca estudia un tipo de TS causado por una mutación en el exón ocho A. Normalmente, durante el desarrollo, las células dejan de utilizar este exón y favorecen el exón ocho, en un proceso mediado por el empalme. Sin embargo, las neuronas de pacientes con este CACNA1C La mutación continúa utilizando el exón mutado. El equipo de Paşca consideró si inhibir el empalme del exón mutado fomentaría el cambio a la variante alternativa intacta y trataría la actividad neuronal desregulada.
El equipo exploró oligonucleótidos antisentido (ASO), que son secuencias cortas de nucleótidos que se unen al ARN objetivo, para inhibir el empalme en el exón ocho A. Trataron neuronas y organoides 3D diferenciados de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) de pacientes con ST con diferentes ASO. Utilizando qPCR y análisis de polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción, encontraron que varios ASO reducían la expresión del exón ocho A.
“El hecho de que puedan hacer que esta variante ocho A sea menos representativa en la población… con la oligoterapia, fue realmente bueno”, dijo Daniel Vogt, un neurocientífico del desarrollo de la Universidad Estatal de Michigan que no participó en la investigación. “Esto demuestra que es factible”.
A continuación, los investigadores investigaron si la expresión reducida del exón ocho A mejoraba la función del canal de calcio CACNA1C. El equipo trató organoides derivados tanto de iPSC normales como de iPSC de pacientes con TS con los candidatos ASO de mayor rendimiento. Utilizando imágenes de calcio y sujeción de parches de células completas, demostraron que ASO revertía el fenotipo de desactivación retardada observado en los organoides TS tratados con control de vehículo.
Para evaluar si ASO corrigió la migración neuronal, el equipo generó dos organoides cerebrales diferentes. Uno de estos organoides incluía neuronas migratorias que los investigadores etiquetaron con GFP para rastrear el movimiento de las células. Cocultivaron estos dos tipos de organoides para formar ensambloides, que modelan diferentes regiones del cerebro que se comunican entre sí, y tomaron imágenes de la migración de las neuronas con microscopía confocal antes y después del tratamiento con ASO. Si bien las neuronas de los ensamblados TS migraron con menos eficiencia en comparación con las derivadas de células normales, el tratamiento con ASO restableció la actividad migratoria normal.
Sergiu Paşca, neurocientífico de la Universidad de Stanford, y su equipo demostraron que los oligonucleótidos antisentido pueden bloquear una variante de empalme mutada en neuronas de pacientes con síndrome de Timothy para restaurar su función.
Universidad Stanford
Paşca explicó que si bien estos resultados fueron emocionantes, todavía estaban todos cocidos en un plato, por lo que él y su equipo recurrieron a un modelo de trasplante estudiar el efecto del ASO in vivo.4 El equipo implantó organoides corticales de neuronas normales o de pacientes con ST en ratas neonatales y les inyectó ASO o solución salina aproximadamente 200 días después.
Al realizar qPCR, el equipo descubrió que ASO disminuía la expresión del exón ocho A tanto en tejidos cerebrales de rata como en tejidos de organoides implantados. Cuando el equipo evaluó la cantidad de calcio dentro de las células después de estimular la despolarización en presencia de un indicador de calcio, descubrieron que el ASO reducía el calcio intracelular en las neuronas organoides corticales de TS iPSC después de la excitación. Utilizando microscopía confocal, el equipo también confirmó que el tratamiento con ASO de organoides TS trasplantados aumentaba la cantidad de proyecciones de dendritas.
Mark Dell’Acqua, un neurocientífico de la Universidad de Colorado que no participó en el estudio, quedó impresionado con la cantidad de enfoques que utilizó el equipo para respaldar sus hallazgos. “Realmente aprovecharon el modelo de neuronas derivadas de iPSC humanas, en particular estos organoides mantenidos in vitro ex vivo, para estudiar cómo se podría revertir el cambio genético utilizando estos oligonucleótidos antisentido alterando el empalme”.
Sin embargo, señaló que algunos de los efectos neurológicos del ST podrían establecerse durante el desarrollo embrionario, y actualmente no está claro si este tipo de tratamiento podría corregir las deficiencias de forma retroactiva. No obstante, dijo que el estudio era un primer paso importante. “Enfatiza una aplicación exitosa adicional de la tecnología ASO para regular el empalme y corregir una enfermedad genética”, dijo Dell’Acqua.
Referencias
- Chen X, et al. Enfoque terapéutico con oligonucleótidos antisentido para el síndrome de Timothy. Naturaleza. 2024;628:818-825
- Paşca SP, et al. Uso de neuronas derivadas de iPSC para descubrir fenotipos celulares asociados con el síndrome de Timothy. Nat Med. 2011;17:1657-1662
- Birey F, et al. Ensamblaje de esferoides del prosencéfalo humano funcionalmente integrados.. Naturaleza. 2017;545:54-59
- Revah O, et al. Maduración e integración de circuitos de organoides corticales humanos trasplantados.. Naturaleza. 2022; 610:319-326