Manténgase actualizado sobre las últimas novedades científicas con los resúmenes de Brush Up.
¿Qué es el Western Blot?
El Western blot, también conocido como inmunotransferencia, es una técnica común de biología molecular que los científicos utilizan para detectar y analizar Proteínas en una muestra biológica.1 Las proteínas totales de la muestra se separan por tamaño mediante electroforesis en gel y luego se transfieren a una membrana de nitrocelulosa, donde se seleccionan las proteínas objetivo específicas. etiquetado con anticuerpos para que puedan ser visualizados.2
Southern, Northern y Western Blot: ¿cuál es la diferencia?La principal diferencia entre las técnicas Southern, Northern y Western blot son las moléculas diana. Mientras que los Western blots se dirigen a las proteínas de una muestra, los Southern blots revelan ADN y los Northern blots indican ARN.3 Estas técnicas suelen utilizar métodos de transferencia y separación de tamaños similares, pero diferentes enfoques de unión y detección. |
¿Para qué se utilizan los Western blots?
Los Western blots no determinan la abundancia absoluta de una proteína objetivo en una muestra, sino más bien la presencia o ausencia de la proteína objetivo en una muestra, así como la abundancia relativa de la proteína objetivo entre diferentes muestras.1
Por ejemplo, si un científico quiere producir grandes cantidades de una proteína particular en una línea celular inmortalizada in vitro pero no está seguro de qué línea celular elegir para esta aplicación, podría tomar varias líneas celulares comunes diferentes, como las células HEK293, HeLa y CHO, transfectar un matraz de cada línea celular con un gen objetivo y cultivar las células durante algunas semanas antes de analizar su contenido de proteína mediante transferencia Western.
Al extraer y medir la concentración total de proteína de cada línea celular y realizar un Western blot, el investigador puede determinar qué líneas celulares son capaces de expresar la proteína y cuáles no. hacer produce la proteína que más produce.
Protocolo Western Blot
Los pasos principales en un protocolo de Western blot son los siguientes.
- Preparación de muestras, incluida la extracción y cuantificación de proteínas.
- Separación de proteínas mediante electroforesis en gel.
- Transferencia de proteínas a través de la membrana del gel
- Inmunotransferencia con anticuerpos primarios y secundarios
- Detección de objetivos
Los investigadores pueden determinar la expresión de proteínas específicas extrayendo y midiendo la concentración total de proteínas de una muestra, separando las muestras mediante electroforesis en gel de poliacrilamida y realizando un protocolo Western blot estándar.
El científico
Preparación de muestras para Western blot: extracción y cuantificación de proteínas
preparación de la muestra es un primer paso crucial para realizar un Western blot preciso.4 Después de extraer la proteína total de las células o el tejido, los investigadores deben medir la concentración de proteína en cada muestra, por ejemplo, utilizando un ensayo de Bradford.
La mayoría de los protocolos de transferencia Western sugieren un máximo de 50 µg de proteína total por muestra; cantidad igual de proteína total entre muestras es fundamental para cualquier tipo de comparación cuantitativa.4 Cargar demasiada proteína total puede causar problemas como la disminución de la unión de proteínas de baja abundancia debido a las proteínas abundantes. saturando la membrana.2
Separación de proteínas mediante electroforesis en gel.
Los científicos separan las proteínas totales en una muestra de transferencia Western por tamaño mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE).
El siguiente paso en un protocolo de transferencia Western es la electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE),3 Los científicos pueden utilizar uno de los dos enfoques principales en esta etapa de preparación de la muestra. El primero es pasar las proteínas nativas por el gel, separándolas por su Carga, masa y estructura (PAGINA nativa).4
El segundo método consiste en desnaturalizar la muestra mediante calor, desdoblando las proteínas y rompiendo los complejos proteicos, y recubriéndolas con dodecil sulfato de sodio (SDS), un detergente aniónico que otorga a todas las proteínas una carga negativa. Este método permite separar las proteínas. solo por su masa (Ficha de datos de seguridad).4
Los investigadores cargan las muestras en los pocillos de un fino gel de poliacrilamida, donde se aplica una corriente eléctrica. Empuja las proteínas a través del gel. matriz; debido a que las proteínas más pequeñas pasan a través del gel más rápidamente, se separan por tamaño.2 Se incluye en un pocillo una escalera de proteínas que contiene un rango de pesos moleculares conocidos para determinar el tamaño en kilodaltons (kDa) de la proteína objetivo.
Transferencia de membrana
Una vez que las proteínas han sido separadas por tamaño mediante PAGE, los científicos transfieren las proteínas a una membrana, generalmente hecha de nitrocelulosa o fluoruro de polivinilideno Materiales de construcción de PVDF (polietileno de baja densidad).5 El gel se coloca cuidadosamente sobre la membrana y se coloca entre papeles de filtro y almohadillas absorbentes previamente empapadas en solución tampón. Luego se aplica una corriente eléctrica para migrar las proteínas del gel a la membrana.3
En esta etapa, los científicos a menudo teñir la membrana con un colorante de unión a proteínas reversible no específico, como Ponceau S o azul de Coomassie, para determinar si la transferencia de proteínas ha sido exitosa y si hay imperfecciones causadas por burbujas de aire entre el gel y la membrana durante la transferencia que afecten la imagen resultante.4
Inmunotransferencia con anticuerpos primarios y secundarios
Después de la transferencia, los investigadores incuban la membrana con anticuerpos para permitir la detección del objetivo. El bloqueo con proteínas de la leche o albúmina de suero bovino (BSA) antes y durante la inmunotransferencia ayuda Prevenir la unión de anticuerpos no específicos en la membrana.6 El anticuerpo primario, específico para la proteína de interés, se diluye en un tampón y se incuba con la membrana. El tiempo y las condiciones de incubación varían según el antígeno y el anticuerpo.
Múltiples pasos de lavado entre las incubaciones de anticuerpos primarios y secundarios. eliminar cualquier anticuerpo primario no unido y reducir la señal de fondo.6 A continuación, se puede aplicar el anticuerpo secundario, que está diseñado para unirse al anticuerpo primario y se conjuga con una enzima, un isótopo radiactivo o un colorante fluorescente que permitirá la detección.3
Detección de objetivos
Los científicos utilizan herramientas de imágenes para visualizar transferencias Western y detectar la proteína objetivo.7 Quimioluminiscencia mejorada (ECL) es el método más común para la detección de proteínas objetivo en Western blotting,5 Pero la fluorescencia también es popular. Debido a que el anticuerpo secundario se une solo al anticuerpo primario específico del objetivo, el proceso de obtención de imágenes producirá una banda en la membrana si el objetivo está presente en una muestra.
Análisis Western Blot: Cómo leer un Western Blot
Bandas en un western blot La imagen revela la presencia, ausencia y abundancia relativa de la proteína objetivo.2 Si no hay ninguna banda presente en una muestra, el objetivo está ausente o puede estar en concentraciones indetectablemente bajas. Si hay bandas presentes, la intensidad de la banda puede revelar las cantidades relativas del objetivo entre muestras;3 Una banda fuerte puede indicar que hay más proteína objetivo presente en una muestra particular, aunque una señal demasiado fuerte puede indicar sobresaturación, que es menos informativa para determinar la abundancia relativa de proteína.
Volviendo al ejemplo anterior de un científico que intenta decidir qué línea celular utilizar para producir una proteína de interés, el investigador puede comparar la expresión entre células HEK293, HeLa y CHO mediante la obtención de imágenes mediante transferencia Western. Si no ve ninguna banda presente en la muestra HEK293, una banda tenue en el caso de las HeLa y una banda intensa en el caso de las CHO, estos resultados indican lo siguiente.
- Las células HEK293 no pueden producir la proteína de interés
- Tanto las células HeLa como las CHO pueden producir la proteína de interés.
- Las células CHO pueden producir la mayor cantidad de proteína objetivo
Consejos para la resolución de problemas con Western Blot
Los Western blots son conocidos por producir imágenes de mala calidad y esto puede deberse a diversos factores. Un problema común que contribuye a un Western blot oscuro y con manchas son las burbujas de aire entre el gel y la membrana durante la transferencia de proteínas. Se debe utilizar un rodillo pequeño para eliminar con cuidado y a fondo las bolsas de aire o las burbujas del gel, asegurando un contacto completo entre el gel y la membrana.
Si se deja que la membrana se seque en cualquier momento, la imagen resultante puede ser oscura y con manchas, lo que dificulta la detección de bandas. Se debe agitar suavemente durante las incubaciones para garantizar una exposición uniforme y continua de la membrana a la solución.
También pueden estar presentes bandas no específicas en un Western blot, a menudo debido a bloqueo insuficientelo que puede contribuir a una señal de fondo alta.2 Además, los anticuerpos primarios deben ser de alta calidad, validados con controles positivos y negativos y utilizados en el concentración óptima para la proteína objetivo para evitar la unión no específica.2
Aplicaciones de Western Blot
El ensayo Western blot tiene una multitud de aplicaciones, desde la investigación básica hasta la aplicada. Los científicos suelen utilizar el Western blot como herramienta de diagnóstico. Por ejemplo, los investigadores desarrollaron una prueba Western blot para determinar la presencia o ausencia de HSV. anticuerpos contra el virus del herpes simple tipo 2 (HSV-2) en muestras de sangre seca.8
De manera similar, los científicos han utilizado una prueba Western blot en el diagnóstico de la enfermedad de Lyme desde principios de la década de 1990.9 Los investigadores también utilizan transferencias Western para mediciones de biomarcadores en el proceso de desarrollo de fármacos.10
- Taylor SC, y otros. Un camino fundamental para producir datos reproducibles y de alta calidad a partir de experimentos de Western blot cuantitativos. Representante científico. 2022;12(1):17599.
- Ghosh R, y col. La necesidad y las estrategias para mejorar la confianza en la precisión de los análisis Western blot.Experto en proteómica. 2014;11(5):549-560.
- Alberts B, y col. Biología molecular de la célula. 5.ª ed. (Anderson M, Granum S, eds.). Garland Science; 2008.
- Sule R, et al. Western blotting (inmunoblotting): Historia, teoría, usos, protocolo y problemas.Biotécnicas. 2023;75(3):99-114.
- DJ MacPhee. Consideraciones metodológicas para mejorar el análisis Western blot. Métodos de J Pharmacol Toxicol. 2010;61(2):171-177.
- Begum H, y col. Western blot: un potente elemento básico en la investigación científica y biomédica. Biotécnicas. 2022;73(1):58-69.
- Gingrich JC, y col. Detección y cuantificación multiplex de proteínas en transferencias Western utilizando sondas fluorescentes. Biotécnicas. 2000;29(3):636-642.
- García-Cisneros S, et al. Rendimiento de ELISA y Western blot para detectar anticuerpos contra HSV-2 utilizando gotas de sangre seca. J Infectar Salud Pública. 2019;12(2):224-228.
- Dressler F, y col. Western blot en el serodiagnóstico de la enfermedad de Lyme. J Infectar Dis. 1993;167(2):392-400.
- Owen C, et al. Western blot: evolución de un antiguo método analítico a una nueva herramienta cuantitativa para la medición de biomarcadores. Bioanálisis. 2024;16(5):319-328.