tLas células B y T del sistema inmunológico adaptativo reconocen características únicas de los microbios infecciosos que ingresan al cuerpo. Lo logran utilizando receptores de células B y T, que adoptan diversas formas para unirse a diferentes antígenos de invasores extraños. Gen activador de recombinación 1 (RAG1) es fundamental para este comportamiento de cambio de forma.1 Cambia el orden de las secuencias de ADN en los genes de estos receptores, produciendo múltiples versiones de los receptores inmunes que pueden unirse a asombrosas combinaciones de antígenos. Sin embargo, algunas personas portan mutaciones en RAG1 que impiden que la enzima recombine las secuencias de ADN que codifican estos receptores. Sin receptores que funcionen adecuadamente, las células B y T no se desarrollan, lo que lleva a una inmunodeficiencia combinada grave (SCID), una afección en la que incluso las infecciones más leves pueden resultar letales. En un estudio publicado en Medicina traslacional científicalos investigadores desarrollaron un método eficiente para reparar RAG1 genes en progenitores de células inmunes llamadas células madre hematopoyéticas (HSC) extraídas de pacientes con SCID, y reveló que podrían restaurar la función inmune en ratones.2
Cuando desee corregir el gen, debe tener en cuenta que cerca del gen hay muchos elementos reguladores que son relevantes para la expresión genética correcta.
-Maria Carmina Castiello, Instituto Científico San Raffaele
María Carmina Castiello y Ana Villados inmunólogos traslacionales del Instituto Científico San Raffaele, se propusieron superar algunos de los desafíos de la edición del RAG1 gen que los investigadores enfrentaron anteriormente. En el pasado, los científicos tomaron HSC sanas y funcionales y las insertaron en ratones modelo SCID, pero a menudo obtienen destruido por otros tipos de células inmunes que reconocen los trasplantes como extraños.3 Normalmente, los médicos utilizan inmunosupresores, como la quimioterapia, antes del trasplante para agotar las células inmunitarias, pero esta no es una opción para los pacientes con SCID. “Esta enfermedad puede estar asociada a daño severo de órganos, por lo que las condiciones críticas de los pacientes no les permiten recibir quimioterapia”, explicó Villa.
Castiello y sus colegas adoptaron un enfoque diferente, modificando las propias células madre de un paciente con SCID para expresar una función RAG1 gene. Mientras que otros grupos de investigación habían añadido con éxito RAG1 al paciente HSC, no pudieron regular adecuadamente la expresión del gen y, por lo tanto, no pudieron garantizar que las células madre fueran seguras o repusieran eficazmente las células B y T.
La introducción del gen en el sitio equivocado del genoma puede haber causado en parte esta deficiencia. “Cuando se desea corregir el gen, hay que tener en cuenta que cerca del gen hay muchos elementos reguladores que son relevantes para la expresión genética correcta”, dijo Castiello.
En lugar de agregar una copia funcional de RAG1, los investigadores decidieron modificar la copia existente, asegurándose de que las redes regulatorias permanecieran intactas. De hecho, otros investigadores tuvieron éxito cuando adoptaron un enfoque similar para editar RAG2.4
Sin embargo, antes de que Castiello y su equipo pudieran arreglar el gen, tuvieron que elegir su estrategia de edición. Algunos investigadores utilizan edición básicaque modifica letras individuales en la secuencia del ADN para corregir otros trastornos genéticos de estas células madre, como la anemia falciforme y la β-talasemia.5
Sin embargo, TRAPO-1 Las mutaciones pueden ocurrir en varios sitios diferentes dentro del gen, por lo que la edición de bases no cubriría todos los tipos de mutación. En cambio, el equipo de investigación utilizó el sistema de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y espaciadas regularmente (CRISPR-Cas9) para cortar una gran sección del gen mutante y luego proporcionó a las células la secuencia de ADN correcta utilizando un sistema de administración lentiviral. Dado que la secuencia correcta era casi idéntica al gen original, la célula podía intercambiar las secuencias sin ayuda mediante la reparación dirigida por homología (HDR), una vía de reparación del ADN incorporada que repara las roturas del ADN de doble hebra utilizando el ADN complementario como plantilla.
Una vez que Castiello y sus colegas cambiaron la antigua secuencia codificante mutada del HSC por una nueva, tuvieron que probar si el gen producía una proteína RAG1 funcional. Insertaron una proteína fluorescente verde al revés (gfp) gen flanqueado por secuencias que reconoce RAG1. De manera prometedora, descubrieron que el RAG1 editado estaba invertido. gfp comparable a RAG1 en HSC de donantes sanos, cambiándolo así a un estado “encendido”, lo que resulta en un funcionamiento gfp gene.
A continuación, tuvieron que comprobar que estas células editadas podían restaurar la función inmune en el cuerpo. Trasplantaron estas células humanas editadas en ratones modelo SCID y descubrieron que las células B y T alcanzaron niveles similares a los observados en ratones que recibieron HSC de donantes sanos.
“Lo interesante del estudio es que no necesitamos corregir todas las células madre. Si logramos corregir al menos el 10 por ciento de las células madre, esto nos va a dar un beneficio terapéutico”, afirmó Saravanabhavan Thangavel, genetista del Instituto de Investigación de Células Madre y Medicina Regenerativa que no participó en el trabajo. Sin embargo, también mencionó: “Necesitamos realizar un seguimiento a largo plazo de las células editadas en HDR”. Los investigadores deben asegurarse de que las células modificadas persistan en los cuerpos de las personas con SCID para que su inmunidad recién adquirida no disminuya con el tiempo. “Si, por casualidad, las células editadas en HDR se desvanecieran, es posible que no tengan un beneficio terapéutico”, añadió Thangavel.
En el futuro, el equipo pretende perfeccionar su protocolo. “Estamos tratando de aumentar la eficiencia de edición que logramos”, dijo Castiello. También quiere optimizar la introducción del gen en las células comparando diferentes métodos. En este estudio utilizaron lentivirus para entregar la plantilla de ADN a las células madre, pero planean probar otras estrategias como el uso de conductos de nanopartículas lipídicas que ocultan la plantilla de ADN y se fusionan con la membrana celular para liberar el ADN en la célula.
El equipo también tendrá que probar la seguridad de esta estrategia de edición de genes y encontrar una manera de aumentar la producción de células madre editadas, añadió Castiello. Luego deberían poder probar sus células editadas en personas con la esperanza de tratar eventualmente la variedad de afecciones causadas por RAG1 defectos. “Estamos realmente comprometidos a trasladar nuestra estrategia a la clínica”, afirmó.
Anna Villa y Maria Carmina Castiello son inventoras con dos patentes relacionadas con la edición de genes RAG.
Referencias
- Lee YN, et al. Caracterización de la diversidad del repertorio de células T y B en pacientes con deficiencia de RAG. ciencia inmunol. 2016;1(6):eaah6109.
- Castiello MC, et al. La edición de genes exónicos knockout y knockin en células madre hematopoyéticas y progenitoras rescata la inmunodeficiencia RAG1. Ciencia Transl Med. 2024;16(733):eadh8162.
- Murphy WJ, et al. Rechazo de aloinjertos de médula ósea por ratones con inmunodeficiencia combinada grave (SCID). Evidencia de que las células asesinas naturales pueden mediar en la especificidad del rechazo del injerto de médula. J Exp Med. 1987;165(4):1212-1217.
- Allen D, et al. Ingeniería CRISPR-Cas9 del locus RAG2 mediante el reemplazo completo de la secuencia de codificación para aplicaciones terapéuticas. comuna nacional. 2023;14(1):6771.
- Antoniou P, et al. Tecnologías de edición base y principal para trastornos sanguíneos.. Ed del genoma frontal. 2021;3:618406.