CRISPR-Cas es muy prometedor para tratar y curar enfermedades humanas. Una de las pocas formas en que los científicos pueden introducir elementos CRISPR en una gran cantidad de células de mamíferos es a través de un vector viral adenoasociado (AAV). Estos vectores son pequeños, por lo que es difícil comprimir el gen grande de la enzima Cas más sus promotores, la señal de poliadenilación, los genes del ARN guía y otros componentes necesarios en un solo vector; dividir los componentes en dos vectores puede crear dosis problemáticas o reducir la eficiencia.
Una forma de encajarlo todo en un vector AAV es reducir el gen grande de la enzima Cas. En un nuevo artículo publicado en Comunicaciones de la naturalezagenetista Zhanjun Li y su equipo de la Universidad de Jilin miniaturizó una enzima Cas13d eliminando bits innecesarios y luego usando una plataforma de inteligencia artificial llamada AlfaFold2 visualizar la estructura de otras proteínas Cas13d y Cas13b y miniaturizarlas.1 Descubrieron que estas minienzimas funcionaban tan bien como las de tipo salvaje.
“No hay muchos ejemplos de proteínas que puedan reducirse a tamaños más pequeños y aún así funcionar”, dijo Jeffrey Chamberlain, genetista de la Universidad de Washington que no participó en el estudio. “Eso podría ser enorme en términos de simplificar la edición de genes mediante el uso de estos vehículos de administración de AAV”.
En el pasado, los investigadores han buscado y encontrado naturalmente más pequeño Proteínas Cas, pero no siempre funcionaron tan bien como las Cas de tamaño completo.2 También han desarrollado otros métodos de miniaturización, pero estos alteran su función. No se ha desarrollado ningún método eficaz y generalizable para reducir el tamaño de las proteínas Cas.
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Li y sus colegas utilizaron una estrategia que llamaron Interacción, Dinámica y Conservación (IDC) para encontrar secciones de la enzima Cas13d que no eran necesarias para su función. (Cas13 es una de las muchas enzimas Cas utilizadas en CRISPR, pero se dirige al ARN, en lugar del ADN como Cas9).
Primero observaron un ejemplo de una proteína Cas13d llamada EsCas13d. Estudios anteriores habían determinado la estructura cristalina de esta proteína usando Cryo-EM, por lo que el equipo utilizó su estrategia IDC para examinar las interacciones entre los sitios funcionales de la enzima EsCas13d, los cambios conformacionales que ocurren a medida que la enzima realiza sus funciones y las unidades estructurales que se conservan y generalizan.3 Los investigadores eligieron ocho secciones de la cadena de aminoácidos que, según la hipótesis, no eran necesarias para su función y las eliminaron, creando mini-EsCas13d.
A continuación, utilizaron AlphaFold para predecir la estructura de otros dos miembros de Cas13d, RfxCas13d y RspCas13d, en función de sus cadenas de aminoácidos. Descubrieron que sus estructuras eran similares (con algunas diferencias clave) a EsCas13d, por lo que se propusieron miniaturizarlas de la misma manera.
Li descubrió que cada mini-Cas13d derribaba el ARN de varios genes en una línea de células HEK293 con aproximadamente el mismo nivel de eficiencia y una longitud óptima del espaciador, tolerancia a desajustes y efectos fuera del objetivo similares que las enzimas de tipo salvaje. El análisis de transferencia Western mostró que el tipo salvaje y el mini-13d también mostraron niveles similares de proteína en las células. Luego, el equipo intentó miniaturizar Cas13b utilizando AlphaFold2 y su estrategia IDC, y creó dos minivariantes con 12 secciones eliminadas, cada una con la misma cantidad de degradación de ARN dirigida que sus contrapartes de tipo salvaje.
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Para ver si las minienzimas funcionaban in vivo, Li y su equipo se dirigieron a la proproteína convertasa murina subtilisina/kexina tipo 9 (PCsk9), que eleva el colesterol en sangre. Inyectaron un plásmido AAV mini-RfxCas13d que contiene crRNA dirigidos a la secuencia codificante de PCsk9 ARNm en la vena de la cola de ratones de 8 semanas. niveles de ARNm de PCsk9 disminuyó significativamente en los ratones inyectados y los niveles de proteína también disminuyeron. “Estas pequeñas proteínas exhibieron una actividad completa similar a la de la enzima de tipo salvaje, y el nivel de colesterol sérico total en los ratones inyectados con AAV se redujo al 61%.+8,3% del nivel normal”, confirmó Li en un correo electrónico. Los indicadores de daño hepático eran normales y el hígado parecía sano.
“El próximo plan es diseñar proteínas más razonables que contengan no sólo miniaturización sino también adición, reemplazo y mutaciones para obtener proteínas Cas de alta fidelidad, hiperprecisas y de alta eficiencia”, dijo Li.
“Lo bueno de esto es que incorporan inteligencia artificial y todo tipo de características aprendidas para analizar realmente la estructura de las proteínas con enorme detalle”, dijo Chamberlain. “Espero que se pueda aplicar un trabajo similar a algunos de los otros casos, como Cas9, que es la enzima de edición de genes más utilizada y que se centra más en el ADN que en el ARN”.
Referencias
- Zhao F, et al. Una estrategia para la miniaturización de Cas13 basada en la estructura y AlphaFold.. comuna nacional. 2023;14:5545.
- Kannan S, et al. Editores de ARN compactos con pequeñas proteínas Cas13. Nat Biotecnología. 2022;40(2):194-7.
- Zhang C, et al. Base estructural de la actividad ribonucleasa guiada por ARN de CRISPR-Cas13d. Celúla. 2018;175(1):212-223.e17.