Los anticuerpos son una de las herramientas más específicas para la detección y captura de dianas moleculares. El anticuerpo adecuado puede desempeñar un papel clave a la hora de revelar la presencia, la cantidad, la dinámica e incluso las interacciones de unión de una proteína objetivo. Sin embargo, encontrar el anticuerpo adecuado entre más de 2 millones de anticuerpos comerciales y más de 300 proveedores puede ser una tarea abrumadora y confusa.1 Hemos recopilado 7 consejos esenciales para ayudarle a iniciar su búsqueda y encontrar el anticuerpo perfecto para su experimento.
1. Elegir el objetivo de interés adecuado
Identificar la proteína o antígeno diana más eficaz y comprender su complejidad es clave para elegir el anticuerpo adecuado. La homología con proteínas estrechamente relacionadas puede dar lugar a reactividad cruzada. Las proteínas pueden tener múltiples nombres, isoformas, variantes de empalme y modificaciones postraduccionales. Si su investigación depende de que el anticuerpo reconozca una porción específica de su objetivo, anote el epítopo contra el que se generó el anticuerpo y confirme que se encuentra dentro del dominio de interés. Los métodos de fijación también pueden alterar un antígeno, y es posible que se requieran tratamientos de permeabilización o recuperación de antígeno para que el objetivo o epítopo sea accesible al anticuerpo. Sin embargo, tanto la fijación como la permeabilización pueden afectar las reacciones de afinidad inmune. Bases de datos de proteínas, como UniProt y Tarjetas genéticasson excelentes recursos para obtener más información.
2. ¿Anticuerpos primarios o secundarios?
Con el marcaje “directo”, los anticuerpos primarios que se unen al antígeno se detectan directamente. El etiquetado “indirecto” se produce cuando se utilizan anticuerpos secundarios marcados para detectar el anticuerpo primario contra el antígeno elegido.
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El uso de anticuerpos primarios marcados directamente requiere menos pasos y reactivos y es el método preferido para algunas aplicaciones que requieren multiplexación (es decir, citometría de flujo), pero la intensidad de la señal es menor ya que solo están presentes los fluoróforos unidos al anticuerpo primario. Dependiendo de su método de detección y del grado de expresión del objetivo, esto puede ser aceptable. Algunos tintes, como nuestros tintes CF®, pueden ayudar a minimizar el problema de la baja señal/ruido, ya que permiten una mayor concentración de moléculas de tinte por anticuerpo y pueden producir un fondo más bajo debido a una mejor solubilidad y una menor unión no específica. Los anticuerpos primarios marcados directamente también permiten a los investigadores multiplexar utilizando una combinación de anticuerpos del mismo huésped. Para obtener más información sobre esto, consulte el consejo técnico de Biotium sobre Combinando IF directo e indirecto utilizando anticuerpos primarios del mismo huésped.
El uso de anticuerpos secundarios requiere más pasos y reactivos, pero aumenta la sensibilidad debido a la amplificación de la señal de múltiples anticuerpos secundarios que se unen a un único anticuerpo primario. Los anticuerpos secundarios también se pueden utilizar en Amplificación de señal de tiramida (TSA) para mejorar aún más la señal de antígenos de baja abundancia y brindar la oportunidad de multiplexación en microscopía. Consulte este útil consejo técnico para obtener más información sobre etiquetado multicolor utilizando kits de amplificación Tyramide.
3. Compatibilidad de especies
Debido a la variación de objetivos entre especies, debe confirmar que su anticuerpo haya sido validado para su especie de muestra. En la mayoría de los casos, querrá seleccionar un anticuerpo creado en una especie huésped diferente de la especie de muestra, especialmente si utiliza anticuerpos secundarios. Generalmente hay anticuerpos validados disponibles para organismos modelo ampliamente investigados. Si no puede encontrar un anticuerpo validado para su especie de muestra, deberá evaluar usted mismo el rendimiento y la especificidad del anticuerpo. Esto vale la pena ya que los anticuerpos a menudo se generan contra dominios relativamente conservados y pueden reconocer su objetivo incluso si la homología de secuencia del epítopo es tan baja como el 75%.2
Los diferentes tipos de inmunoglobulinas (IgG, IgM, IgY, etc.) también pueden afectar la reactividad cruzada y la multiplexación. Por ejemplo, los anticuerpos secundarios que reaccionan con IgG (H+L) reaccionarán con epítopos tanto en las cadenas pesadas como en las ligeras, por lo que reaccionarán con otros isotipos de anticuerpo primario o diferentes subtipos de IgG. Los anticuerpos secundarios que especifican un isotipo específico por su reactividad (p. ej., IgG2a) se adsorben de forma cruzada con otros isotipos para lograr una unión específica.3 Si busca intensidad de señal y amplitud de detección por encima de especificidad, considere los anticuerpos policlonales, que son una mezcla de anticuerpos que reconocen diferentes epítopos en un objetivo determinado. Si su experimento requiere un mayor grado de especificidad y consistencia, es posible que desee considerar los anticuerpos monoclonales.
4. Formulación y grado de purificación.
Los anticuerpos están disponibles en diversas formulaciones y grados de purificación. Los anticuerpos pueden suministrarse como IgG pura en PBS, pero también pueden venir con estabilizadores como BSA, gelatina, glicerol o aminoácidos. Las preparaciones crudas de anticuerpos en suero, líquido ascítico o sobrenadante pueden contener inmunoglobulinas no deseadas u otros componentes que tal vez deban eliminarse para evitar sesgar los resultados. Esto es especialmente importante si planea marcar su propio anticuerpo con un tinte fluorescente u otro tipo de etiqueta, ya que aditivos como aminoácidos, glicerol o Tris pueden afectar la eficiencia del etiquetado.
5. Validación de anticuerpos y aplicaciones.
Seleccionar un anticuerpo que haya sido validado de forma independiente puede ayudarle a obtener resultados exitosos. Los proveedores suelen incluir aplicaciones validadas en línea o en los documentos del producto. Nunca asuma que los anticuerpos validados para una aplicación, como la transferencia Western, funcionarán bien en otra, como la citometría de flujo, ya que el estado del antígeno puede cambiar con la técnica (p. ej., el antígeno generalmente se desnaturalizará en la transferencia Western mientras que el La forma nativa suele estar presente para microscopía o citometría de flujo). Encontrar ejemplos publicados de un anticuerpo utilizado en un experimento similar al suyo es uno de los mejores predictores de éxito. PubMed y CiteAb son excelentes recursos para determinar qué anticuerpos están utilizando otros investigadores. También vale la pena buscar anticuerpos validados por el vendedor. Biotium ofrece una selección de monoclonales Anticuerpos de elección de biotio que han sido cuidadosamente seleccionados y ampliamente validados internamente para citometría de flujo.
6. Multiplexación
La multiplexación permite la detección simultánea de múltiples marcadores en una sola muestra. Es esencial una consideración cuidadosa de las especies y clases de inmunoglobulinas para minimizar la reactividad cruzada y los antecedentes. Los anticuerpos altamente adsorbidos de forma cruzada funcionan mejor y la mayoría de los investigadores prefieren usar anticuerpos primarios conjugados directamente, ya que algunos experimentos pueden requerir hasta docenas de anticuerpos diferentes. Si utiliza anticuerpos marcados con fluorescencia, recuerde elegir conjugados que no tengan espectros de emisión superpuestos.
Biotio
7. Recursos proporcionados por el proveedor
La mayoría de los experimentos requieren solución de problemas y optimización. Elegir un proveedor con soporte técnico experto y recursos útiles le ahorrará tiempo y reactivos valiosos. Consulte estos materiales para determinar cuál es la mejor manera de reconstituir, almacenar y dividir en alícuotas su anticuerpo, y tome nota de las consideraciones especiales enumeradas. Estos documentos también suelen proporcionar sugerencias de concentraciones óptimas para diferentes aplicaciones. Además de los documentos de información del producto, Biotium ofrece una herramienta de selección de anticuerpos y una variedad de consejos técnicos y protocolos generales para la detección basada en anticuerpos. Nuestros científicos de soporte técnico siempre estarán felices de ayudar con la resolución de problemas experimentales una vez que sus anticuerpos también se hayan puesto en uso.
Referencias
- panadero, m. Crisis de reproducibilidad: la culpa es de los anticuerpos. Naturaleza 521, 274–276 (2015). https://doi.org/10.1038/521274a
- ¿Cómo sé si el anticuerpo tendrá una reacción cruzada?https://www.ptglab.com/news/blog/how-do-i-know-if-the-antibody-will-cross-react/
- (2021, 2 de septiembre). ¿El anticuerpo secundario anti-IgG tendrá una reacción cruzada con el anticuerpo primario IgM? – Biotio. https://biotium.com/faqs/will-anti-igg-secondary-antibody-cross-react-with-igm-primary-antibody/