yoAl igual que la función de búsqueda y reemplazo de un procesador de textos, la ingeniería basada en CRISPR permite a los científicos editar secuencias de ADN de manera rápida y eficiente con precisión de pares de bases. Elogiado como el gran democratizador de la edición genética, Tecnologías CRISPR Contamos con modelado avanzado de enfermedades, genómica funcional y terapias genéticas.1 Sin embargo, las herramientas similares para la edición de ARN siguen siendo limitadas.
A primera vista, puede parecer contradictorio editar una molécula transitoria como el ARN cuando existen herramientas para atacar la raíz del problema: el ADN. Sin embargo, la edición del ADN no está exenta de riesgos, como las mutaciones fuera del objetivo, y su permanencia es limitante cuando se desea una solución temporal, como intervenciones de desarrollo o tratamientos contra el cáncer a corto plazo. “Aquí es donde la edición del ARN podría realmente cambiar las reglas del juego”, dijo Ana Nemudraiabiólogo molecular de la Universidad Estatal de Montana (MSU).
En un artículo publicado en CienciaNemudraia y sus colegas utilizaron un sistema CRISPR único para escindir el ARN en células humanas e identificaron el mecanismo de reparación que utilizan las células para volver a unir la molécula.2 Utilizando modelos celulares, el equipo demostró que su tecnología eliminó una mutación causante de enfermedades común en pacientes con fibrosis quística. Los hallazgos resaltan el potencial terapéutico de la edición programable de ARN, pero también brindan a los investigadores una herramienta para estudiar cuestiones más fundamentales en la biología del ARN, como cómo y por qué las células humanas reparan el ARN.
Artem Nemudryi (primer plano) y Anna Nemudraia (segundo plano) se inspiraron para estudiar la edición de ARN guiada por CRISPR luego de una observación que realizaron mientras analizaban variantes del SARS-CoV-2 durante la pandemia de COVID-19.
Adrián Sánchez-González
“El artículo en general es muy creativo”, dijo David Coxun genetista de la Universidad de Stanford que no participó en el estudio.[This technology] “Se sumará al arsenal de herramientas de edición de ARN que están disponibles, especialmente para células de mamíferos”.
“[The research] “Se inspiró en una observación que hicimos durante la pandemia de COVID-19”, dijo Artem Nemudriigenetista de la MSU y coautor del artículo. En 2020, Nemudryi y Nemudraia estaban estudiando los sistemas CRISPR en Blake WiedenheftEl laboratorio de la Universidad de Nottingham, pero cambiaron de rumbo para estudiar las mutaciones del virus SARS-CoV-2, sumándose al esfuerzo global por comprender cómo el genoma de este virus de ARN cambió con el tiempo. Mientras exploraban las mutaciones en ORF7a, una proteína accesoria viral que antagoniza las respuestas antivirales del huésped, descubrieron una cepa rara con una Deleción de 115 nucleótidos de longitud en el genoma de ARN de 30.000 nucleótidos de longitud del virus.3
A medida que los tratamientos y las vacunas estuvieron disponibles, los investigadores tuvieron tiempo de preguntarse cómo los virus de ARN reparan las deleciones en su genoma y comenzaron a buscar herramientas que les permitieran inducir directamente cortes en el ARN viral. Las endonucleasas guiadas por CRISPR eran una ruta obvia, pero para el ARN, las opciones eran pocas e imperfectas. Cas13 resultó útil para la eliminación del ARN, pero causó daños colaterales al ARN no objetivo. Aunque el mutante inactivado por nucleasa dCas13 no provocó una escisión fuera del objetivo, sus capacidades de edición aún son limitadas: no pueden inducir eliminaciones programables en una ubicación específica en la secuencia de ARN.4
“Nuestra motivación para este trabajo fue descubrir otras posibilidades para la edición de ARN”, dijo Nemudryi; estaba buscando un sistema que pudiera sustituir o eliminar fragmentos de ácidos nucleicos en el genoma viral. El equipo de investigación aterrizó en un complejo CRISPR tipo III, que, como Cas13, se dirige al ARN, pero lo hace de una manera extraña, o más bien, par: corta el ARN en incrementos de seis nucleótidos.5 “El sistema CRISPR tipo III es muy sofisticado y único”, afirmó Nemudraia.
En un estudio publicado el año pasado en Avances científicosLos investigadores utilizaron esta ribonucleasa CRISPR para hacer fragmentos con intervalos de seis nucleótidos en ARN viral para deleciones o inserciones programadas en el genoma.6 Tras este éxito viral, los investigadores se preguntaron si este sistema CRISPR de tipo III también podría editar el ARN humano. Para comprobarlo, dirigieron el sistema hacia dos transcripciones que se expresan en gran medida en la línea celular humana HEK293T y luego secuenciaron el ARN.
“El momento más emocionante de este trabajo fue cuando obtuvimos la primera secuencia”, dijo Nemudryi. Los investigadores estaban observando la alineación de las lecturas de secuenciación cuando notaron espacios que eran consistentes con el patrón de división de seis nucleótidos. “Este tipo de deleciones de seis, 12 o 18 [nucleotides]no ocurren al azar: sabíamos en ese momento que hay [RNA] “Estamos realizando reparaciones”, dijo Nemudryi.
Cuando los complejos CRISPR tipo III cortan el ARN, dejan una huella química en cada uno de los dos sitios de corte.7 En las células de mamíferos, endógenas empalme del ARN de transferencia provoca las mismas marcas, que la ARN ligasa RTCB vuelve a unir.8 Los experimentos de derribo y sobreexpresión de RTCB ayudaron a confirmar que esta costurera enzimática también estaba reparando el daño infligido por un actor exógeno, el complejo CRISPR.
“Como alguien que ha trabajado en el campo del ARN y la ingeniería del ARN, es bastante sorprendente que estos [CRISPR-guided] “Las roturas de ARN se reparan”, dijo Cox. Dado que el ARN es una molécula transitoria, el dogma es que una célula eliminaría las transcripciones dañadas y sintetizaría otras nuevas. “Estamos interesados en el papel fisiológico de este proceso”, dijo Nemudryi. “¿Las células reparan el ARN y por qué lo hacen?”
Para explorar la utilidad clínica de su tecnología, los investigadores la probaron en un modelo celular de fibrosis quística que expresaba una mutación en el regulador de conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR) transcripción. La mutación, un codón de terminación prematuro, hace sonar las alarmas de la célula una vez que la transcripción entra en el citoplasma, lo que desencadena su descomposición antes de que se convierta en una proteína funcional. Los niveles insuficientes de CFTR afectan el transporte de iones en los pulmones y contribuyen al desarrollo de la fibrosis quística. Los investigadores programaron un CRISPR tipo III para atacar la mutación. CFTR El complejo CRISPR, que albergaba una etiqueta especial que localizaba su expresión en el núcleo de la célula, buscaba y editaba el ARNm defectuoso antes de que escapara al citoplasma.
Aunque los investigadores demostraron que su herramienta de edición de ARN de ruptura y reparación eliminó el CFTR En el caso de la mutación, la eficiencia era baja, algo que los investigadores observaron que es un problema común que todos los editores CRISPR atraviesan al principio de su desarrollo. Además, observaron que la versión actual del CRISPR tipo III tiene mente propia y cambia su patrón de corte de un objetivo a otro. Por ejemplo, el complejo puede hacer tres cortes y cortar 12 nucleótidos en un objetivo, pero inducir cuatro cortes para eliminar 18 nucleótidos en otro. Con más ajustes al sistema, esperan controlar la ribonucleasa para lograr una edición de ARN más precisa y eficiente.
Nemudryi y Nemudraia, que han estado trabajando codo a codo en el laboratorio durante los últimos seis años, comenzarán su propio grupo de investigación en la Universidad de Florida este otoño, donde continuarán estos esfuerzos.
“La belleza de este trabajo es que no es solo una tecnología, sino que también creamos una herramienta”, dijo Nemudraia, quien espera utilizar el sistema de corte y reparación guiado por CRISPR para explorar más a fondo los mecanismos de reparación del ARN.