miLos endosomas, pequeñas vesículas lipídicas que clasifican y transportan biomoléculas entre otros compartimentos y orgánulos subcelulares, son fundamentales para la red de transporte interno y el funcionamiento general de la célula. Sin embargo, se desconocía la forma en que el sistema endosómico pasa la carga de un endosoma al siguiente de manera oportuna. Harrison Yorkbiólogo celular del Laboratorio de Fisiología Celular de la Universidad de Monash y coautor de un estudio publicado en Comunicaciones de la naturalezaanalizaron cómo los nuevos avances tecnológicos en imágenes, como la microscopía de lámina de luz en red (LLSM) y la microscopía de imágenes de vida útil fluorescente (FLIM), permiten nuevos enfoques para visualizar y caracterizar el comportamiento endosómico.1
¿Por qué fue difícil visualizar el movimiento endosómico?
La principal limitación era la resolución temporal, ya que los endosomas se mueven increíblemente rápido. Por ejemplo, los investigadores que utilizaban la microscopía confocal de disco giratorio no podían obtener imágenes de todos los endosomas de una célula a una velocidad lo suficientemente rápida como para visualizar todos sus movimientos. Esto permitía una comprensión aproximada de la maduración endosómica, pero no era posible seguir realmente el proceso. No podían investigar cuántos endosomas maduran por unidad de tiempo ni observar aspectos de nivel superior, como la organización y la regulación.
La otra preocupación era el fotoblanqueo. Los endosomas son bastante pequeños y cada vez que se iluminan existe el riesgo de blanquear las señales emitidas por los fluoróforos de marcado. Además, la microscopía confocal ilumina (y por lo tanto fotoblanquea) toda la muestra durante la visualización, pero solo puede capturar una porción delgada del plano Z a la vez. Esto limita la duración y, al mismo tiempo, la rapidez con la que se puede registrar un fenómeno.
¿Qué es LLSM y qué le motivó a tomar la decisión de utilizarlo?
La microscopía de láminas de luz (LLSM) es una técnica desarrollada por el premio Nobel Eric Betzig y su equipo de investigación. La microscopía de láminas de luz utiliza una lámina de luz plana delgada en lugar de un único punto para escanear rápidamente una muestra plano por plano. Sin embargo, las láminas de luz convencionales o las llamadas “láminas de luz gaussianas” son demasiado gruesas en escalas de longitud celular para resolver orgánulos y son más adecuadas para estudiar estructuras más grandes, como órganos dentro de animales en desarrollo. Se requiere una lámina de luz más delgada para la obtención de imágenes subcelulares. En este caso, el grupo de Betzig empleó la “formación de haz” para crear una lámina de luz estructurada de aproximadamente 400 nm (en lugar de los cuatro o cinco micrómetros de una lámina de luz gaussiana). La LLSM nos permitió obtener imágenes rápidas de cada endosoma dentro de una célula con alta resolución y durante períodos lo suficientemente largos como para poder rastrear con precisión sus trayectorias, capturar fenómenos como las colisiones entre endosomas y medir las tasas de conversión del conjunto.
¿Por qué complementaron LLSM con FLIM?
La técnica FLIM nos permitió inferir si dos proteínas estaban en contacto o no, lo que usamos para determinar qué extremo de una proteína estaba unido a una vesícula determinada. La técnica FLIM, en mi opinión, es una de las técnicas menos utilizadas en la obtención de imágenes. Siempre que se excita un fluoróforo, este entra en un estado excitado, luego cae a un estado fundamental y emite un fotón. Este proceso normalmente lleva un par de nanosegundos, pero está influenciado por el entorno local que rodea al fluoróforo. El seguimiento de estos tiempos de llegada de fotones puede proporcionar información sobre el entorno del fluoróforo. Por ejemplo, cuando dos fluoróforos que se superponen espectralmente están a una distancia de entre cinco y diez nanómetros entre sí, puede tener lugar una interacción de transferencia de energía por resonancia de Förster (FRET) que hace que el segundo fluoróforo emita un fotón. Estos fotones derivados de la FRET se pueden detectar porque acortan el tiempo promedio general que se tarda en recibir un fotón y, por lo tanto, nos permiten detectar cuándo las proteínas están unidas directamente entre sí.
¿Cómo podemos utilizar estas estrategias y tecnologías de imágenes para estudiar otros fenómenos biológicos?
La biología es un campo increíblemente rico y repleto de procesos dinámicos, y la capacidad de obtener imágenes de estos procesos tiene un gran potencial de aplicación. Este estudio es solo un ejemplo de cómo la observación de los procesos intracelulares nativos puede ayudar a descubrir los mecanismos que rigen la organización y la solidez de la vida. Los avances continuos en microscopía han permitido a los científicos obtener imágenes más rápidas, durante más tiempo, a mayor profundidad y con mayor resolución. Esto está ampliando la gama de muestras que se pueden observar, lo que nos permite plantear preguntas sobre cómo funcionan estas dinámicas celulares en los contextos locales de las células durante el desarrollo y la enfermedad.
Esta entrevista ha sido condensada y editada para mayor claridad.