W.gallina programas de televisión como CSI: Investigación de la escena del crimen Representa el procesamiento de ADN en el laboratorio forense, los resultados aparecen instantáneamente y una coincidencia de ADN concluye el caso en horas. Sin embargo, el proceso detrás de escena del análisis del ADN forense es mucho más complejo y requiere una interpretación cuidadosa de los datos.
La elaboración de perfiles de ADN forense utiliza la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar repeticiones cortas en tándem (STR), que son regiones de ADN muy variables, generalmente con cuatro bases repetidas. Esta variabilidad ayuda científicos forenses identificar individuos. Sin embargo, durante la PCR, la polimerasa puede deslizarse en las repeticiones, creando picos “entrecortados”, fragmentos que son una repetición más cortos que el pico real.
Desde la llegada de la PCR, los científicos han desarrollado filtros para gestionar la tartamudez predecible, pero sigue siendo un punto de frustración al interpretar los perfiles de ADN. “Es especialmente difícil cuando se trata de mezclas de ADN”, dijo Julia Sikorskycientífico forense y director de la Unidad de Biología Forense de la Oficina del Sheriff del condado de Palm Beach. Los niveles de ADN pueden variar. “Tienes estos trazas de contribuyentes, y estos picos alélicos pueden quedar enmascarados por tartamudeo o puedes interpretar un pico alélico como tartamudeo”.
Muchos investigadores han intentado abordar este desafío, pero han tenido un éxito limitado. Recientemente, en el Simposio Internacional sobre Identificación Humana (ISHI), los científicos de Promega Corporation anunciaron un nueva ADN polimerasa eso redujo drásticamente la tartamudez.
“Cuando comenzamos nuestro proyecto hace unos años, no pensamos que fuera posible hacerlo, porque muchas personas lo habían intentado antes y no lo habían logrado”, dijo Bob McLarenbioquímico de Promega.
Cuando McLaren y sus colegas abordaron la difícil tarea, se centraron en una pregunta clave: ¿por qué ocurre la tartamudez en primer lugar? “Nuestra hipótesis es que el deslizamiento de la cadena, o tartamudeo, es causado por el deslizamiento del ADN contra la ADN polimerasa a la que se une y que realiza la polimerización”, dijo David Mokrybioquímico de Promega.
Exploraron combinaciones de varias polimerasas y dominios de unión al ADN, centrándose en motivos estructurales de la naturaleza. Se sintieron particularmente atraídos por las características de la ADN polimerasa T7, derivada del bacteriófago T7 que infecta Escherichia coli—debido a su capacidad para sintetizar largos tramos de ADN uniéndose y permaneciendo unidos durante períodos prolongados.
El equipo se centró en el dominio de unión a tiorredoxina (TBD) de la ADN polimerasa T7, que tiene una estructura similar a la de la mayoría de las polimerasas termoestables, incluida la Taq. La tioredoxina, que es omnipresente en las células, se une a TBD, provocando un cambio conformacional que ayuda a TBD a mejorar la procesividad de la polimerasa. “Entonces, fue en la misma línea que pensar si teníamos que mejorar la procesividad al tener el ADN [polymerase] se unen más estrechamente alrededor del ADN en el sitio activo”, dijo McLaren.
Su objetivo era mejorar la Taq polimerasa incorporando esta característica de la ADN polimerasa T7. Diseñaron una versión modificada de la polimerasa Taq uniendo tiorredoxina a TBD y colocando el dominio cerca del sitio activo, donde la polimerasa agrega nucleótidos a la cadena de ADN en crecimiento. Mokry organizó su experimento, ejecutando la amplificación con su ADN polimerasa quimérica. Luego, entregó las muestras a Nick Courtneybioquímico de Promega, para realizar electroforesis capilar, que separó los fragmentos amplificados, y examinar los picos de datos.
Los científicos investigadores de Promega Corporation (de izquierda a derecha) Bob McLaren, Nick Courtney y David Mokry dieron a conocer una nueva enzima que reduce significativamente los artefactos de tartamudez en el análisis forense de ADN.
Corporación Promega
Cuando Courtney vio los datos, no podía creer lo que veía. “Llevé mi computadora portátil y corrí hacia [David’s] escritorio, y yo dije, ‘oh, tienes que ver esto’, porque no solo funcionó, sino que pasó de no funcionar a funcionar razonablemente bien en un día”. Lograron una reducción de aproximadamente el 85 por ciento en la tartamudez en todos los loci. Pero el equipo quería mejorarlo aún más. Utilizando el aprendizaje automático, analizaron secuencias de aminoácidos para identificar mutaciones que mejoraban la unión de la polimerasa a su cadena plantilla. Luego, probaron su enzima mejorada en mezclas de dos y cinco contribuyentes y observaron una mayor reducción de la tartamudez por debajo de los niveles de ruido. Además, esta enzima funciona a través de un flujo de trabajo y una sensibilidad comparables a los sistemas STR tradicionales.
Este proceso de desarrollo y refinamiento tomó algunos años. Cuando el equipo presentó su tan esperado anuncio revolucionario en ISHI para la comunidad científica forense, Sikorsky recordó la reacción de la audiencia como una mezcla de silencio atónito y emoción. Después de haber luchado contra la tartamudez durante décadas, Sikorsky, que no participó en el desarrollo de la enzima, expresó su optimismo por la nueva enzima y su potencial para agilizar el análisis de ADN para los casos. “Poder incorporar una herramienta como ésta va a revolucionar el campo”. Y añadió: “Entonces, sin tener que preocuparnos por ese pico de tartamudeo, aumenta la confianza en nuestra interpretación del ADN, lo que nos permite tener un número más preciso de estimaciones de contribuyentes”. Aunque la enzima aún no está disponible comercialmente, el equipo de investigación está trabajando en la creación de un kit para que lo utilicen los analistas forenses.
Divulgación de conflictos de intereses: Promega Corporation ha solicitado una patente para esta enzima para su uso en análisis STR.