Dirigir reactivos superiores para obtener mejores resultados de PCR

norteLa amplificación del ácido ucleico revolucionó la investigación en las ciencias biológicas. La capacidad de replicar secuencias genéticas no sólo ha demostrado ser esencial para una mejor entendimiento de genética y genómica, pero la amplificación de ácidos nucleicos también ha permitido a los científicos crear innumerables herramientas experimentales, desde reactivos y proteínas recombinantes hasta modelos completos.¹ La amplificación del ácido nucleico incluso forma el núcleo de muchos ensayos empleados actualmente tanto para estudiar los mecanismos de la enfermedad como para realizar diagnósticos clínicos.² Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) condujo gran parte de esta revolución,³ y a medida que la técnica se acerca a sus 40^th aniversario, los científicos continúan mejorando su eficiencia, confiabilidad y aplicabilidad.

Una entrada fuerte impulsa una producción fuerte

La PCR implica tres componentes principales: polimerasa, cebador y plantilla. Los cebadores se hibridan con las plantillas y crean sitios de iniciación para la polimerasa. Luego, la polimerasa recluta desoxinucleósidos trifosfatos libres (dNTP) para generar una cadena complementaria. Luego, este proceso se repite a través de ciclos de desnaturalización, recocido y elongación, lo que produce una amplificación exponencial. La PCR convencional proporciona un punto de datos singular una vez finalizada la amplificación, lo que limita su capacidad para proporcionar información cuantitativa. Esto llevó a los científicos a desarrollar la PCR cuantitativa (qPCR), que mide la abundancia de amplificación después de cada ciclo de desnaturalización-hibridación-elongación.

Ya sea convencional o cuantitativa, una PCR exitosa depende de la integridad de la reacción, que a su vez depende de la calidad de sus ingredientes. Por ejemplo, para maximizar la eficiencia de disociación, los cebadores deben diseñarse de manera que tengan temperaturas de fusión similares. No deben recocerse entre sí, evitando dímeros y otros productos no específicos. Además, los parámetros de termociclado, así como las concentraciones de magnesio, potasio y dNTP dentro de la reacción, deben adaptarse a las propiedades de la plantilla, el cebador, la polimerasa y el producto.⁴ Finalmente, diferentes enzimas polimerasas poseen diferentes velocidades de transcripción, eficiencias y tasas de error, y los investigadores deben conocer las fortalezas y debilidades de la enzima con la que están trabajando.⁵

Dirigir mejores reactivos

En última instancia, los reactivos robustos y consistentes son esenciales para una PCR y qPCR eficientes y consistentes. Para ello, los científicos buscan constantemente formas de mejorar los reactivos de la PCR. Una forma de hacerlo es a través evolución dirigida. Aquí, los investigadores simulan y aceleran los procesos de selección natural induciendo mutagénesis en genes que codifican proteínas de interés. Esto se hace de forma aleatoria (por ejemplo, mediante el uso intencionado de una polimerasa propensa a errores) o mediante recombinación dirigida. Luego, los científicos analizan los productos posteriores para encontrar mutantes con propiedades beneficiosas y funcionalidad mejorada, y luego los seleccionan para su amplificación. Este ciclo se puede repetir hasta que se pueda identificar y aislar un producto final que contenga las propiedades deseadas.⁶

La evolución dirigida tiene Estimuló avances en las ciencias biológicas, produciendo proteínas con una vida útil prolongada, afinidad de unión modificada y funcionalidad alterada. La PCR no es ajena a los beneficios de la evolución dirigida. Por ejemplo, los investigadores lo han utilizado para alterar la Taq Enzima ADN polimerasa de la bacteria. Termo acuático para una polimerización más eficaz de segmentos de ADN de más de 25 kilobases. Utilizando este enfoque, también convirtieron Taq de una ADN polimerasa a una ARN polimerasa.⁷

Más precisión, velocidad y confiabilidad

El conjunto de reactivos de PCR y qPCR de KAPA Biosystems se generan mediante evolución dirigida y contienen nuevas enzimas polimerasas sintetizadas con actividad específica mejorada, mayor fidelidad, mayor procesividad y resistencia a los inhibidores de PCR comunes en mente. Por ejemplo, el sistema de PCR de largo alcance KAPA utiliza dos ADN polimerasas:Taq y una polimerasa de la familia B de arqueas modificada con actividad de corrección de pruebas, para admitir mejor aplicaciones de PCR sensibles y de largo alcance. Esta combinación posee de tres a cuatro veces mayor fidelidad de replicación que Taq polimerasa sola. Alternativamente, la ADN polimerasa KAPA2G FAST HotStart® es una enzima de segunda generación formulada para una mayor procesividad y velocidad, que ofrece tasas de extensión significativamente más rápidas que las de tipo salvaje. Taq ADN polimerasa. Finalmente, los kits KAPA PROBE FORCE qPCR combinan una enzima ADN polimerasa de tercera generación con una mezcla maestra que elimina la necesidad de purificación del ADN y es resistente a inhibidores de muestras de sangre, tejidos y plantas, lo que los hace ideales para muestras crudas.

Los reactivos y kits de PCR y qPCR de KAPA Biosystems, diseñados mediante evolución dirigida, se crean con el objetivo de lograr una mayor confiabilidad, consistencia, eficacia y aplicabilidad, incluso cuando se enfrentan a las plantillas y materiales de partida más desafiantes.

Referencias

1. Fakruddin M, et al. Amplificación de ácidos nucleicos: métodos alternativos de reacción en cadena de la polimerasa. Ciencia bioaliada de J Pharm. 2013;5(4):245-52.
2. Wang M, et al. Amplificación de ácidos nucleicos asistida por enzimas en el diagnóstico molecular: una revisión. Biosensores (Basilea). 2023;13(2):160.
3. Oliveira BB, et al. Amplificación isotérmica de ácidos nucleicos: la carrera por el próximo “estándar de oro”. Sensor frontal. 2021;2:752600.
4. Lorenz TC. Reacción en cadena de la polimerasa: protocolo básico más estrategias de optimización y resolución de problemas. J Vis Exp. 2012;(63):e3998.
5. Ishino S, Ishino Y. Las ADN polimerasas como reactivos útiles para la biotecnología: la historia del desarrollo de la investigación en este campo. Microbiol frontal. 2014;5:465.
6. Arnold FH. Evolución dirigida: dar vida a una nueva química. Angew Chem Int Ed Engl. 2018; 57(16):4143-48.
7. Kaur J, Sharma R. Evolución dirigida: un enfoque para diseñar enzimas. Crit Rev Biotecnología. 2006;26(3):165-99.