Información sobre qPCR: protocolo, métodos de detección y análisis

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¿Qué es la qPCR?

La reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) es una técnica molecular que ha remodelado el panorama de la investigación y la medicina biológicas debido a su alta sensibilidad y especificidad.

La qPCR, también conocida como PCR en tiempo real, es una extensión de la PCR tradicional, en la que la amplificación del ADN a lo largo del tiempo se cuantifica midiendo la fluorescencia de los tintes que se intercalan en las cadenas de ADN nacientes o mediante la escisión de sondas específicas del objetivo. Por lo tanto, el método Combina la detección con la amplificación, proporcionando a los investigadores datos cruciales en tiempo real.¹

Al igual que la PCR, la qPCR amplifica el ADN mediante un enzima ADN polimerasa. Esto agrega nuevos nucleótidos al extremo 3′-OH de un segmento corto de ADN monocatenario, llamado cebador, que complementa la hebra plantilla.² La reacción ocurre en termocicladores especializados equipados con fluorómetros que miden señales fluorescentes, cuantificando cantidades de ADN tanto relativas como absolutas cuando se combinan con valores de referencia.

RT-PCR frente a qPCR

La PCR con transcripción inversa (RT-PCR) a menudo se confunde con la PCR en tiempo real. La RT-PCR utiliza un enzima transcriptasa inversa para convertir el ácido ribonucleico (ARN) en ADN complementario (ADNc).¹ Cuando se combina con qPCR, el método se denomina PCR cuantitativa en tiempo real con transcripción inversa. (RT-qPCR).³ RT-qPCR es una herramienta poderosa porque permite a los investigadores medir la expresión genética de genes específicos utilizando ARN como plantilla.

Aplicaciones comunes de qPCR

La monitorización en tiempo real, la alta sensibilidad y la especificidad permiten la medición precisa del material genético y hacen que la qPCR sea invaluable para diversas aplicaciones. A continuación se enumeran algunos ejemplos clave.

• Perfiles de expresión genética.
• Detección de patógenos
• Estudios de variación genética.
• Monitoreo ambiental
• Diagnóstico clínico

¿Cómo funciona la qPCR?

Una reacción típica de qPCR comienza con una mezcla maestra que contiene ADN polimerasa, trifosfatos de desoxinucleótidos (dNTP), cebadores, un tinte o indicador y ADN molde.⁴ La reacción se desarrolla en un termociclador, programado para aproximadamente 35-40 ciclos de amplificación, precedidos por una fase de desnaturalización inicial.

Condiciones clave del ciclo qPCR

• Desnaturalización: Las cadenas de ADN se separan a alta temperatura (94-98°C).
• Recocido: Los cebadores se unen a la región objetivo específica del ADN molde (50-70°C).
• Extensión: La ADN polimerasa genera dos cadenas de ADN complementarias añadiendo nucleótidos a los cebadores (68-72°C).
• Cuantificación: Un fluorómetro registra la fluorescencia emitida al final de cada ciclo de amplificación.

Métodos clave de detección de qPCR

Los científicos pueden emplear varios métodos de detección en experimentos de qPCR, según la aplicación específica y la naturaleza de la molécula objetivo. Algunos métodos comunes de detección de qPCR se describen en la siguiente tabla.

Tabla 1: Métodos comunes de detección de qPCR con sus pros y sus contras

Controles importantes de qPCR

Los controles adecuados en un ensayo de qPCR garantizan la confiabilidad y precisión y ayudan a rastrear cualquier problema potencial al mismo tiempo que proporcionan una línea de base para la cuantificación relativa.

Algunos controles importantes incluyen los siguientes.

• El sin control de plantilla (NTC) contiene todos los componentes de la mezcla maestra excepto la plantilla. Cualquier amplificación detectada sugiere contaminación de la muestra.
• El control negativo proviene de la muestra pero carece del gen de interés. No muestra amplificación o puede revelar una amplificación no objetivo.
• El control positivo incluye la plantilla de muestra y ninguna amplificación sugiere un error en el ensayo.
• El control endógeno Es un gen de mantenimiento con expresión consistente en todas las condiciones experimentales y es crucial para la cuantificación relativa.

Consideraciones clave para el diseño de cebadores de qPCR

El diseño exitoso del cebador de qPCR es fundamental para una amplificación específica y eficiente. A continuación se detallan algunas consideraciones importantes a tener en cuenta.⁶

• Idealmente, los cebadores deberían tener entre 15 y 30 pares de bases de largo (lo óptimo para amplicones cortos, entre 70 y 200 pb).
• Diseñe cebadores directos e inversos con temperaturas de fusión (Tm) similares, con el objetivo de una Tm de alrededor de 60-65 °C.
• Los extremos del cebador deben ser ricos en GC para permitir una unión eficaz de la plantilla y altas temperaturas de fusión. Diseñe cebadores con un contenido de GC del 40 al 60 por ciento para permitir la especificidad, la estabilidad y la amplificación óptima del cebador.
• La temperatura de hibridación debe ser aproximadamente 5 °C inferior a la Tm del par de cebadores para evitar una amplificación no específica.

Análisis qPCR, valor Ct, curva estándar y el ΔΔMétodo CT

El análisis de los resultados de qPCR se centra en un gráfico de amplificación, que traza el número de ciclo frente a la señal fluorescente. Los ciclos iniciales de qPCR con amplificación mínima y señales fluorescentes relativamente bajas forman una base para el análisis. En un número de ciclo específico, conocido como ciclo umbral (Ct), la señal fluorescente excede la línea base.

Los científicos pueden cuantificar los resultados de qPCR mediante cuantificación absoluta o relativa. Cuantificación absoluta determina el ADN o ARN objetivo total en muestras experimentales según un gráfico estándar. Cuantificación relativa determina cambios en la muestra en relación con una referencia, generalmente un control no tratado, utiliza genes endógenos con expresión consistente y se puede medir usando un curva estándar⁷ o un comparativo ΔΔMétodo TC.⁸

• El método de curva estándar utiliza cinco o más puntos de datos y diluciones en serie de la misma plantilla, como ADN plasmídico previamente cuantificado, productos de PCR o ADN sintético.
• El método Ct comparativo Implica la cuantificación relativa (RQ) de los niveles de expresión de un gen objetivo utilizando un gen de referencia endógeno, generalmente un gen de mantenimiento con expresión consistente en todas las condiciones experimentales. La fórmula para calcular el RQ es la siguiente.

RQ = 2^{−ΔΔConnecticut}

ΔΔCT = ΔCt (muestra tratada) − ΔCt (control no tratado)

ΔCt (muestra tratada) = Ct (gen diana en tratados) − Ct (gen de referencia en tratados)

ΔCt (control sin tratar) = Ct (gen diana en no tratados) − Ct (gen de referencia en no tratados)

En conclusión, qPCR es una técnica fundamental en biología molecular, que permite la cuantificación precisa de ácidos nucleicos y respalda diversas aplicaciones como genética, diagnóstico y más.

Referencias:

1. Adams G. Una guía para principiantes sobre RT-PCR, qPCR y RT-qPCR. Biochem (Londres). 2020;42(3):48–53.
2. Ishino S, Ishino Y. Las ADN polimerasas como reactivos útiles para la biotecnología: la historia del desarrollo de la investigación en este campo. Microbiol frontal. 2014;5:465.
3. Udvardi MK, et al. Once reglas de oro de la RT-PCR cuantitativa. Célula vegetal. 2008;20(7):1736-1737.
4. Yang J, et al. La fuente de la mezcla maestra verde SYBR determina el resultado de las reacciones de amplificación de ácidos nucleicos. Notas de resolución de BMC. 2016;9:292.
5. Cremallera H, et al. Investigaciones sobre la intercalación de ADN y unión a superficie por SYBR Green I, su determinación de estructura e implicaciones metodológicas.. Investigación de ácidos nucleicos2004;32(12):e103
6. Bustin S, Huggett J. Revisión del diseño del cebador qPCR. Biomol Detect Quantif. 2017;14:19-28.
7. Larionov A, et al. Un método estándar basado en curvas para el procesamiento de datos de PCR en tiempo real relativo. BMC Bioinformática. 2005;6:62.
8. Livak KJ, Schmittgen TD. Análisis de datos de expresión genética relativa mediante PCR cuantitativa en tiempo real y el método 2 (-Delta Delta C (T)). Métodos. 2001;25(4):402-408.