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IA mediados de los años 1990, Hiroyuki Nakai, ahora investigador de virus adenoasociados (AAV) en la Universidad de Ciencias y Salud de Oregón, se mudó a los Estados Unidos. Nakai rápidamente quedó fascinado con la biología de los virus pequeños y su potencial como vehículos de distribución de genes, y el AAV y sus aplicaciones en terapia génica pronto se convirtieron en su principal objetivo. “Es un virus simple. Si se cambia un aminoácido, se puede cambiar totalmente el fenotipo y mejorar sustancialmente la infectividad en los tejidos específicos sin infectar otros tejidos no específicos”, explicó Nakai. «Como científico, esto es realmente interesante de entender».

Los investigadores encuentran interesante el potencial de los vectores AAV en la terapia génica por varias razones. Por un lado, exhiben una toxicidad e inmunogenicidad reducidas en comparación con otros vectores virales, como los adenovirus y los retrovirus. Además, la naturaleza altamente personalizable de la cápside de AAV, la cubierta proteica que encierra el ADN viral monocatenario y afecta la afinidad del vector por las células y los tejidos, permite a los científicos diseñar vectores de AAV que entreguen genes terapéuticos de manera más eficiente a los órganos específicos.

Aunque los científicos han estado probando AAV terapia de genes solicitudes durante más de dos décadas, los métodos de selección convencionales son engorrosos. Los científicos tienen que lidiar con variaciones entre animales e interexperimentales al comparar los resultados de pruebas independientes de AAV. Además, cuando se realizan estudios en un solo tipo de célula u órgano, no pueden determinar si las variantes de AAV transdujeron más de un tejido, enmascarando una falta de especificidad que potencialmente las haría inadecuadas para uso clínico. Por último, para validar un amplio panel de vectores candidatos de VAA, los científicos deben utilizar una gran cantidad de animales de laboratorio, lo que impone limitaciones éticas.

Un cribado de vectores AAV más rápido y más amplio

Alrededor de 2010, Nakai conceptualizó una nueva tecnología que ayudó a resolver estos problemas: el Sec. de código de barras AAV acercarse.1 Motivado por la reducción del costo de la secuenciación de próxima generación (NGS), Nakai quería aplicar esta tecnología para caracterizar biológicamente múltiples AAV de una manera de alto rendimiento.

Es un método rentable, éticamente mejor y eficaz en el tiempo para estudiar muchos AAV diferentes al mismo tiempo.

-Leszek Lisowski, Instituto de Investigación Médica Infantil de la Universidad de Sydney.

La idea de Nakai era añadir secuencias de ADN pequeñas y únicas a los genomas virales. Al igual que los códigos de barras de los productos del supermercado, estas secuencias de ADN añaden etiquetas únicas a cada AAV. En sus experimentos de detección de AAV, que normalmente implicaban una mezcla de diferentes AAV, el equipo amplificó y secuenciaó los códigos de barras para identificar vectores individuales. También evaluaron la presencia de AAV específicos en diferentes tejidos. Siguiendo una serie de pasos comunes de biología molecular, los investigadores utilizaron la tecnología AAV Barcode-Seq para comparar las eficiencias de transducción relativas de 12 cepas diferentes de AAV en muchos tejidos diferentes, utilizando tan solo tres ratones. También utilizaron el método para crear mutantes de AAV serotipo 9 (AAV9) y demostraron cómo las firmas de aminoácidos específicos en la cápside influyen en el comportamiento de un vector, incluida su afinidad tisular, su eliminación sanguínea y su neutralización mediada por anticuerpos.

Si bien este estudio de prueba de concepto introdujo la tecnología de códigos de barras de ADN combinada con NGS en el campo de AAV, los investigadores tardaron un tiempo en apreciar la utilidad del método después de que se hizo público por primera vez, según Nakai. Eso ha cambiado ahora. «Muchas personas en nuestro campo han comenzado a utilizar nuestra tecnología y han desarrollado su propio método modificando el nuestro», dijo Nakai.

Llévandolo al siguiente nivel

El equipo de Nakai realizó algunas de las primeras mejoras en la tecnología al permitir el seguimiento de AAV en el nivel de ARN.2 Para hacer esto, su equipo diseñó una biblioteca de AAV compuesta por 25 clones virales recombinantes de AAV serotipo 2 (AAV2) y colocó el código de barras de ADN aguas abajo de una secuencia promotora en el AAV para asegurar la expresión del código de barras en la molécula de ARN. Al transducir células con la biblioteca, confirmaron que la secuencia del código de barras aparecía en la transcripción, abriendo así el método para determinar la expresión del transgén.

La capacidad de la tecnología para rastrear vectores AAV tanto a nivel de ADN como de ARN despertó el interés de científicos como Leszek Lisowski, biólogo molecular y genetista del Instituto de Investigación Médica Infantil de la Universidad de Sydney, que quería probar el método para aplicaciones in vitro, in vivo y ex vivo. «Es un método rentable, éticamente mejor y eficaz en el tiempo para estudiar muchos AAV diferentes al mismo tiempo», dijo Lisowski.

Él y su equipo seleccionaron 30 variantes de AAV publicadas anteriormente, una mezcla de vectores naturales y de bioingeniería, y las ensamblaron en un kit de prueba VAA para probar la capacidad de la tecnología para rastrear los vectores en diferentes condiciones experimentales.3 Cada AAV llevaba un casete transgénico de proteína fluorescente verde mejorada (eGFP) junto con un código de barras único de seis nucleótidos de longitud. Utilizando este enfoque, el equipo confirmó hallazgos anteriores de que los vectores AAV transducían eficazmente tejidos específicos, como el cerebro de ratón y los hepatocitos humanos, y descubrió una nueva variante que transducía eficazmente fibroblastos humanos primarios ex vivo.

Aunque la idea de añadir una etiqueta para rastrear un vector AAV parece simple, la selección de esta pequeña secuencia de ADN y su ubicación dentro del genoma viral debe pensarse cuidadosamente para un uso específico, según Lisowski. “Podemos afectar la estabilidad del ARN agregando un código de barras a una matriz de genes muy simple. Si es así, eso significa que algo expresado con ese código de barras se destruiría más rápido”, explicó. “Al medir la expresión del transgén parecerá que nunca estuvo ahí y que el vector no funcionó, pero [it] trabajó. Es sólo que el ARN fue destruido. Por lo tanto, todos los códigos de barras deben validarse”.

La capacidad de comparar diferentes AAV utilizando el método AAV Barcode-Seq también es útil cuando se trabaja con primates no humanos. Los estudios de detección de AAV en primates no humanos, como los macacos rhesus, a menudo están limitados por la alta variabilidad en los resultados que se debe en parte a los antecedentes genéticos más distintos de los animales y a la posible inmunidad preexistente a algunos de los AAV. Dado que los primates no humanos son biológicamente más cercanos a los humanos que los ratones, los científicos están interesados ​​en probar vectores de AAV en estos modelos para identificar las variantes de AAV con aplicaciones prometedoras de terapia génica en humanos.

Esta tecnología de códigos de barras AAV y otros tipos de tecnologías de alto rendimiento en las que nosotros y otros laboratorios estamos trabajando pueden transformar sustancialmente el campo de la terapia génica en los próximos 10 años aproximadamente.

-Hiroyuki Nakai, Universidad de Ciencias y Salud de Oregón.

Interesado en probar un panel distinto de vectores AAV que podrían administrar terapias contra el VIH directamente a las células T, Daniel Piedraterapeuta genética en Keith JerónimoEl laboratorio del Fred Hutchinson Cancer Center, colaboró ​​con otros investigadores para optimizar el proceso de selección de AAV en primates no humanos utilizando el método AAV Barcode-Seq.4 «Queríamos identificar algunos serotipos de AAV que serían óptimos para atacar las células T CD4+ o los músculos y el hígado como sitios para la expresión de anticuerpos ampliamente neutralizantes», dijo Stone. «Decidimos observar varios serotipos al mismo tiempo que potencialmente podrían atacar a todas esas poblaciones diferentes».

El equipo utilizó códigos de barras de seis nucleótidos de largo para identificar cada vector de AAV en un panel que consta de vectores naturales y de ingeniería de cápside. Utilizando el método AAV Barcode-Seq, los investigadores compararon el rendimiento del AAV directamente, minimizando las variables experimentales que a menudo obstaculizaban la evaluación en dichos estudios. «Existen técnicas disponibles que le permiten identificar algo que se adapta a su indicación particular, y puede hacerlo en una escala más pequeña», dijo Stone.

En el laboratorio de Nakai, él y su equipo ahora están aplicando la tecnología para investigar enfermedades, como algunas enfermedades renales crónicas hereditarias, que tienen una base genética bien conocida y una necesidad apremiante de terapias novedosas.

A diferencia de otros órganos, la entrega de genes al riñón mediada por AAV se caracteriza por una alta eficiencia de transducción variable.5 En un intento por identificar nuevos vectores de AAV que podrían usarse potencialmente para la terapia génica renal, Nakai y su equipo compararon más de 45 variantes de AAV utilizando AAV Barcode-Seq e identificaron seis que mostraban transducción renal mejorada y transducción limitada fuera del objetivo en ratones cuando se administra de forma más local.6 Cuando se administró sistémicamente a un modelo de ratón con enfermedad renal crónica, la variante con mejor rendimiento mostró una transducción deficiente en los riñones. Aunque el hallazgo fue contrario a sus expectativas, reveló la importancia del contexto de selección (sano versus enfermo) al evaluar el desempeño de los AAV candidatos para la terapia génica renal.

El futuro de las tecnologías AAV Barcode-Seq

Aunque AAV Barcode-Seq proporciona una plataforma para la detección de alto rendimiento de vectores AAV, el método tiene limitaciones. Como los investigadores necesitan mezclar todos los vectores en el mismo conjunto, algunos expresaron su preocupación por la competencia de los AAV, recordó Nakai. Para ingresar a una célula, un AAV debe unirse a un receptor en la superficie celular. Si otro AAV se une primero a ese receptor, podría interferir con la entrada del primer AAV. Aunque esto es posible, todavía faltan pruebas de la competencia de los AAV, según Lisowski. «Siempre hablamos de ello como una posibilidad teórica, pero nunca la habíamos visto», dijo.

Según Lisowski, un inconveniente importante del método es que los investigadores no pueden saber qué tipos de células dentro de un tejido se están transduciendo. «Esto se puede hacer cuando se estudia un vector a la vez», explicó. En este contexto, científicos como Lisowski están utilizando tecnologías AAV Barcode-Seq para limitar la selección de vectores AAV e identificar los más prometedores, que luego se estudian individualmente.

A pesar de las limitaciones, Nakai defiende estas tecnologías. “Hay muchos [of] promesas futuras en términos de desarrollo de AAV específicos de enfermedades o células que puedan administrarse en una dosis mucho más baja que la que utilizamos ahora”, dijo Nakai. «Esta tecnología de códigos de barras AAV y otros tipos de tecnologías de alto rendimiento en las que nosotros y otros laboratorios estamos trabajando pueden transformar sustancialmente el campo de la terapia génica en los próximos 10 años aproximadamente».

Hiroyuki Nakai es uno de los fundadores de Capsigen Inc., donde actúa como director científico. También recibe regalías por tecnologías relacionadas con AAV con licencia de Takara Bio Inc.

Referencias

  1. Adachi K, et al. Dibujar un mapa funcional de alta resolución de la cápside del virus adenoasociado mediante secuenciación masiva paralela. comuna nacional. 2014;5:3075.
  2. Adachi K, et al. 288. Desarrollo de un sistema universal AAV Barcode-Seq que expresa códigos de barras de ARN. Mol Ther. 2014;22:S111.
  3. Westhaus A, et al. Detección de alto rendimiento in vitro, ex vivo e in vivo de vectores de virus adenoasociados basada en transducción física y funcional. Hum Gene Ther. 2020;31(9-10):575-589.
  4. Piedra D, et al. Un enfoque de código de barras multiplexado para evaluar simultáneamente la administración de genes mediante variantes de la cápside del virus adenoasociado en primates no humanos. Hepatol común. 2023;7(2):e0009.
  5. Peek JL, Wilson MH. Terapia celular y genética para la enfermedad renal. Nat Rev Nephrol. 2023;19(7):451-462.
  6. Furusho T, et al. Mejora de la transferencia de genes a túbulos renales y podocitos mediante la selección de cápsides de AAV dependiente del contexto. Preimpresión. bioRxiv. 2023