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W.Cuando los científicos comenzaron a aplicar CRISPR para la edición del genoma en células humanas, abrió las compuertas para estudiar la genética de las enfermedades. En esos primeros días de edición con CRISPR-Cas9, investigador de oncología de precisión Francisco Sánchez Rivera era un estudiante de posgrado que investigaba la genética del cáncer en tyler jacks‘laboratorio del Instituto Tecnológico de Massachusetts (MIT). En su trabajo de posgrado, estuvo entre los primeros en editar genomas de ratón con CRISPR-Cas9 mientras interrogaba los factores genéticos del cáncer de pulmón. Estos estudios impulsaron el interés de Sánchez-Rivera en la edición del genoma de alto rendimiento, lo que impulsa su investigación actual en el MIT.

El investigador de oncología de precisión Francisco Sánchez-Rivera crea herramientas de investigación de alto rendimiento para investigar cómo la variación genética da forma a la fisiología y la enfermedad normales.

Steve Boxall

En una reciente Naturaleza Biotecnología estudio, Sánchez-Rivera colaboró ​​con el bioquímico David Liu en la Universidad de Harvard para examinar el gen del cáncer mutado con mayor frecuencia: TP53que codifica al guardián del genoma, proteína supresora de tumores p53. Investigaron miles de variantes de p53 con una nueva biblioteca de sensores de edición principal de alto rendimiento que evalúa cuantitativamente cómo las diferentes mutaciones afectan la función de la proteína endógena.

Sánchez-Rivera y su equipo descubrieron que ciertas mutaciones causan fenotipos que difieren de los observados previamente en sistemas modelo de sobreexpresión, particularmente aquellos que afectan el dominio de oligomerización que permite a las proteínas p53 formar tetrámeros funcionales en las células. El trabajo de Sánchez-Rivera subraya la importancia de la dosificación de genes endógenos en la investigación de genética tumoral y establece un marco para el interrogatorio de variantes genéticas a gran escala para futuros descubrimientos en medicina de precisión.

¿Qué te inspiró a investigar la genética del cáncer con edición principal?

El sistema CRISPR-Cas9 no es muy adecuado para diseñar mutaciones específicas relacionadas con el cáncer, como variantes de un solo nucleótido, polimorfismos de un solo nucleótido, inserciones y eliminaciones, y diferentes tipos de reordenamientos cromosómicos. Durante mi formación postdoctoral con biólogo oncológico Scott Lowe en el Memorial Sloan Kettering Cancer Center, centré mis esfuerzos en tecnologías de edición genómica de precisión, como la edición de bases de citosina y la edición de bases de adenina, desarrolladas inicialmente en el laboratorio de David Liu por Alexis Komor (ahora bioquímico de la Universidad de California, San Diego) y Nicole Gaudelli (ahora emprendedor en Google Ventures), respectivamente. Esas tecnologías nos permitieron diseñar alteraciones específicas de un solo nucleótido en genomas celulares y realizar la edición del genoma somático in vivo en ratones. Eso llevó a reutilizar la edición base CRISPR para genómica funcional de alto rendimiento, lo que preparó el escenario para nuestro trabajo de edición principal. Edición principal Fue desarrollado por David Liu y Andrés Anzalone (ahora director de Prime Medicine), y es realmente lo que considero el santo grial de la edición genómica de precisión porque nos permite diseñar prácticamente cualquier tipo de mutación.

¿Cómo se mide la edición del genoma durante las pantallas CRISPR de alto rendimiento?

El ARN guía de la nucleasa Cas9 (gRNA) original rompe el ADN y normalmente induce pérdida de función o mutaciones inactivadoras. En ese contexto, los recuentos de ARNg recopilados mediante secuenciación de próxima generación proporcionan una medición indirecta de las propiedades promotoras del fitness de una guía. Para la edición básica y la edición principal, confiar en los recuentos de ARNg en una célula no es tan preciso ni cuantitativo. Desarrollamos bibliotecas de sensores para mitigar esos desafíos.

¿Qué son las bibliotecas de sensores y cómo funcionan?

Nos permite cuantificar simultáneamente la eficiencia de edición y la precisión de cada pegRNA dentro de una biblioteca tal como sucede en las células.
-Francisco Sánchez-Rivera, Instituto Tecnológico de Massachusetts

Las bibliotecas de sensores son construcciones que codifican un ARNg y una versión sintética del sitio objetivo en la misma construcción. Aunque es un sitio objetivo sintético el que diseñamos y clonamos, en el contexto de una biblioteca de sensores, ese sitio objetivo está diseñado para imitar el sitio endógeno lo más fielmente posible. Incluimos el sitio objetivo y las secuencias de ADN flanqueantes, que se basan en la secuencia del locus endógeno.

Anteriormente demostramos que podíamos obtener una medición indirecta de la edición básica eventos que ocurrían endógenamente al secuenciar este sitio objetivo sintético en la construcción durante una pantalla de alto rendimiento.2 En este estudiotomamos una página de ese libro y creamos una biblioteca de sensores de edición principal.1

El ARN guía de edición principal (pegRNA) es una construcción más complicada en general, pero el concepto es el mismo. Si introducimos estas bibliotecas en células que expresan maquinaria de edición primaria, el pegRNA dentro de la construcción editará su sitio objetivo en el sensor, y si las bibliotecas se entregan en células de la misma especie objetivo, el pegRNA editará el sitio genómico endógeno. Esto es poderoso porque nos permite cuantificar simultáneamente la eficiencia de edición y la precisión de cada pegRNA dentro de una biblioteca tal como sucede en las células.

¿Por qué se centró en p53 al desarrollar bibliotecas de sensores de edición principal?

Utilizamos p53 como prototipo por varias razones. El gen que codifica p53 es el gen cancerígeno más comúnmente mutadoy todavía hay mucha controversia sobre lo que hacen estas mutaciones.3

Variantes de p53 renderizadas en 3D unidas al ADN.

p53 es un factor de transcripción que forma tetrámeros activos a través de interacciones proteína-proteína, que facilitan la unión al ADN y las funciones supresoras de tumores. Como el gen cancerígeno más comúnmente mutado, los científicos han identificado miles de variantes de p53 relacionadas con la enfermedad.

Cada célula humana comienza con dos copias de p53 de tipo salvaje. Normalmente, el primer evento que ocurre cuando una célula adquiere una mutación p53 es una mutación puntual en una copia, seguida de un evento de pérdida de heterocigosidad, que muta o pierde la segunda. TP53 copia del gen. Varios estudios han empleado mutagénesis basada en ADNc exógeno o enfoques de exploración mutacional profunda para sobreexpresar diferentes mutantes que abarcan el TP53 gene. Estos estudios se han realizado en células que expresan p53 de tipo salvaje, como las células de adenocarcinoma de pulmón que utilizamos en nuestro estudio.

En términos genéticos, la única propiedad que se puede medir a través de ese enfoque es la actividad negativa dominante, lo que significa que el mutante se introduce en el contexto del tetrámero de tipo salvaje, y la actividad negativa dominante interfiere con ese conjunto de p53 de tipo salvaje. Pero hay ciertos mutantes que pueden tener otras propiedades, no sólo actividad negativa dominante.

Queríamos llegar al punto en el que pudiéramos probar rigurosamente este modelo y este trabajo es sólo el comienzo. Con la edición principal, diseñamos mutaciones endógenas, manteniendo la estequiometría, la dosis de genes y la forma nativa en que estas mutaciones surgen y progresan. Este método también nos permitió establecer la tecnología de manera muy rigurosa porque aplicamos una fuerte selección de células con actividad de p53 alterada, por lo que rápidamente tuvimos una idea de si la tecnología es robusta y escalable.

¿Cuáles son las direcciones futuras?

Este campo se mueve rápidamente pero a veces sufrimos que se mueva tan rápido que nos olvidamos de hacer los experimentos más importantes. Interrogar mecánicamente a estos mutantes es definitivamente parte de nuestros próximos pasos. Volvemos a modelos de ratón para diseñar diferentes tipos de mutaciones en diversos tejidos para comprender qué están haciendo in vivo. Además de modelar mutaciones individuales, esperamos realizar una edición primaria múltiple en el contexto de un experimento genético de mayor rendimiento en modelos de ratón, tal como lo hicimos en células.

Esta entrevista ha sido editada para mayor extensión y claridad.

Referencias

  1. Gould SI, et al. Evaluación de alto rendimiento de variantes genéticas con bibliotecas de sensores de edición primaria. Biotecnología Nat. Publicado en línea el 12 de marzo de 2024. doi:10.1038/s41587-024-02172-9
  2. Sánchez-Rivera FJ, et al. Bibliotecas de sensores de edición básica para ingeniería de alto rendimiento y análisis funcional de variantes de un solo nucleótido asociadas al cáncer. Biotecnología Nat. 2022;40(6):862-873.
  3. Huang J. Desarrollos actuales para apuntar a la vía de señalización p53 para el tratamiento del cáncer. Farmacol Ther. 2021;220:107720.