El láser del cirujano acababa de romper el cálculo renal cuando algo llamó la atención de Kymora Scotland. Estaba examinando los fragmentos bajo el microscopio en UCLA. Fragmentos que, según la sabiduría popular, no deberían contener más que cristales. En cambio, vio algo vivo.
Entre los cristales de oxalato de calcio había células bacterianas, envueltas en la matriz fibrosa característica de las biopelículas. No sólo bacterias dispersas que podrían haber contaminado la muestra, sino comunidades organizadas, incrustadas en lo profundo de la estructura interna de la piedra. Scotland, uróloga, se dio cuenta de que estaba ante algo que se suponía que no existía. Durante décadas, los cálculos renales a base de calcio, del tipo que afecta aproximadamente a 1 de cada 11 personas, se han considerado formaciones puramente químicas, agregados estériles de minerales que cristalizan en orina sobresaturada. Los únicos cálculos tradicionalmente relacionados con bacterias eran los raros cálculos de estruvita, que representaban sólo entre el 2 y el 6 por ciento de los casos.
El descubrimiento de Escocia sugiere que nos hemos equivocado fundamentalmente acerca de cómo se forma el tipo más común de cálculo renal. Los cálculos de oxalato de calcio constituyen casi el 80 por ciento de todos los cálculos renales. Si las bacterias son parte integral de su formación y no pasajeros incidentales, cambia todo lo que creíamos saber sobre la nefrolitiasis.
El equipo dirigido por la UCLA utilizó un arsenal de técnicas de imagen avanzadas (microscopía electrónica de barrido, microscopía fluorescente, corte por haz de iones enfocado) para observar el interior de los cálculos renales humanos recolectados durante la cirugía. Lo que encontraron desafió las suposiciones mantenidas desde el inicio del campo. En cálculo tras cálculo, incluidos muchos de pacientes sin infecciones del tracto urinario, aparecieron biopelículas bacterianas como componentes estructurales intrínsecos. Las piedras no estaban simplemente colonizadas en sus superficies; Las bacterias se intercalaron por todas partes, formando capas distintas entre los depósitos minerales cristalinos.
Cuando Scotland y sus colegas pulieron las piedras y las tiñeron para detectar ADN, la organización bacteriana se volvió aún más sorprendente. Bandas fluorescentes de ADN se iluminaron en franjas regulares, marcando capas bacterianas con “alta regularidad en espesor y periodicidad”, como informa el equipo en las Actas de la Academia Nacional de Ciencias. Las bacterias no eran intrusos aleatorios. Eran parte de la arquitectura.
La evidencia fue más allá de los patrones visuales. Cuando los investigadores midieron los tamaños de los cristales en diferentes regiones de las piedras, encontraron algo revelador sobre el papel de las bacterias. En áreas donde había biopelículas bacterianas, los cristales de oxalato de calcio tenían un diámetro promedio de sólo 7 micrómetros. En capas puramente cristalinas sin bacterias, los cristales se hincharon hasta un promedio de 236 micrómetros: más de 30 veces más grandes. La dramática diferencia de tamaño apunta a una mayor concentración de sitios de nucleación en áreas bacterianas, lo que sugiere que los microbios promueven activamente la formación de cristales en lugar de simplemente vivir entre piedras ya formadas.
Para confirmar que las bacterias eran reales y no solo artefactos con forma de bacterias, el equipo aplicó tinciones químicas que se unen selectivamente a componentes exclusivos de las biopelículas microbianas: lípidos de las membranas celulares, polisacáridos de la matriz protectora y ADN de ambas células y la estructura de la biopelícula circundante. Las muestras de control de minerales de oxalato de calcio puro no mostraron tinción preferencial. Los cálculos renales humanos se iluminaron.
Quizás lo más sorprendente fue que surgieron bacterias viables cuando se cultivaron piedras. De los 22 cálculos analizados, 17 albergaban microbios vivos a pesar de que muchos de ellos dieron resultados negativos en las pruebas clínicas estándar. Las concentraciones bacterianas oscilaban en más de seis órdenes de magnitud, y la lista de especies parecía un quién es quién de los habitantes del tracto urinario: Enterococcus faecalis, Proteus mirabilis, Escherichia coli, Staphylococcus epidermidis. Más del 30 por ciento de las piedras albergaban múltiples especies, lo que sugiere que ecosistemas microbianos complejos pueden establecerse dentro del entorno de las piedras.
El equipo, que incluía investigadores de la Universidad de Washington y la Universidad de Illinois, fue más allá. Utilizando fresado con haz de iones enfocado (esencialmente una herramienta quirúrgica de precisión que funciona a nanoescala), diseccionaron piedras capa por capa bajo un vacío ultra alto. Aparecieron grandes vacíos dentro de los cristales, y llenando esos vacíos estaban bacterias y biopelículas. Los microbios no estaban sólo en la superficie. Fueron sepultados en lo más profundo, incrustados durante el crecimiento de la piedra.
“Este avance desafía la suposición de larga data de que estas piedras se desarrollan únicamente mediante procesos químicos y físicos”, dice Scotland. El descubrimiento abre preguntas sobre por qué las bacterias estarían allí. Las biopelículas normalmente se forman donde las bacterias tienen acceso a los nutrientes y pueden anclarse, no dentro de depósitos minerales. El coautor Gerard Wong, que estudia la química física de los sistemas biológicos en la UCLA, sospechaba que la respuesta podría estar en la lucha de las bacterias por sobrevivir en la orina.
La orina presenta un desafío particular para las bacterias: está cargada de calcio, hasta 7 milimolar en comparación con aproximadamente 1 milimolar en los fluidos biológicos normales. Las bacterias deben mantener un gradiente pronunciado de calcio a través de sus membranas (aproximadamente 100 nanomolar en el interior, 1 milimolar en el exterior) o mueren. Bombear todo ese calcio extra cuesta energía. Pero hay otra estrategia: producir ADN extracelular.
Cuando las bacterias liberan ADN en la matriz de biopelícula que las rodea, sucede algo interesante desde una perspectiva física. El ADN es una molécula altamente cargada, que transporta aproximadamente 5,8 cargas negativas por nanómetro a lo largo de su columna vertebral de azúcar y fosfato. Esa densidad de carga es más de cuatro veces mayor que la de los polímeros sintéticos estudiados previamente como posibles inhibidores del crecimiento de cristales. También es lo suficientemente alto como para desencadenar lo que se llama condensación de Manning, donde los iones de calcio cargados positivamente son atraídos y “se condensan” alrededor del ADN cargado negativamente en una vaina concentrada.
Esta condensación secuestra eficazmente los iones de calcio del medio ambiente, aliviando a las bacterias de la carga metabólica de bombearlos constantemente. Pero esas moléculas de ADN recubiertas de calcio se convierten en plantillas: sitios de nucleación donde pueden comenzar a formarse cristales de oxalato de calcio. Una sola célula bacteriana, si se lisa, libera alrededor de 4 megabases de ADN, suficiente para secuestrar unos 3,6 millones de iones de calcio divalentes.
“Encontramos un nuevo mecanismo de formación de cálculos que puede ayudar a explicar por qué estos cálculos son tan comunes”, dice Scotland. Estudios recientes muestran que Pseudomonas aeruginosa, una bacteria que a veces se encuentra en infecciones del tracto urinario, secreta cantidades anormalmente grandes de ADN extracelular cuando se cultiva en orina. El propio ambiente de la orina puede estar desencadenando el mismo comportamiento que promueve la formación de cálculos.
Los hallazgos podrían explicar misterios clínicos de larga data. ¿Por qué los cálculos renales reaparecen con tanta frecuencia (hasta un 80 por ciento de recurrencia en algunas poblaciones de pacientes)? Si las bacterias permanecen viables dentro de los cálculos, incluso los pequeños fragmentos que quedan después de la extirpación quirúrgica podrían provocar el crecimiento de nuevos cálculos. ¿Por qué existe una conexión entre las infecciones recurrentes del tracto urinario y los cálculos renales recurrentes? El vínculo puede ser más directo que circunstancial si las bacterias son agentes causales y no colonos oportunistas.
Escocia enfatiza que la participación bacteriana no significa que todos los cálculos renales sean “infecciosos” en el sentido tradicional. Muchos pacientes no tenían infecciones subyacentes del tracto urinario. Las bacterias pueden ser habitantes normales del tracto urinario que, en las condiciones adecuadas (alta concentración de calcio, cierta dinámica de flujo, química particular de la orina), pasan de ser residentes inofensivos a catalizadores de formación de cálculos.
Las implicaciones se extienden hacia afuera. Los tratamientos actuales para los cálculos de oxalato de calcio son limitados: hidratación, cambios en la dieta y extirpación quirúrgica. Los antibióticos se utilizan para los cálculos de estruvita pero no para los cálculos de calcio, en parte porque los cálculos de calcio se han considerado abióticos y en parte porque la resistencia a los antibióticos es una preocupación legítima. Pero si las bacterias desempeñan un papel causal, atacarlas (o las biopelículas que forman) podría ofrecer nuevas estrategias de prevención.
“Nuestro equipo multiinstitucional está realizando actualmente estudios para determinar cómo interactúan las bacterias y los cálculos renales a base de calcio”, dice Scotland. “Queremos comprender exactamente qué hace que algunos pacientes sean particularmente susceptibles a la formación recurrente de cálculos, y qué tienen estas especies particulares de bacterias que les permite nuclear estos cálculos”.
Una pregunta abierta es si las bacterias son la causa principal o los contribuyentes secundarios. ¿Inician la formación de cálculos o primero se forman pequeños cristales y luego proporcionan superficies para la adhesión bacteriana, lo que luego acelera el crecimiento? Las capas intercaladas sugieren ciclos de deposición mineral y colonización bacteriana, pero la secuencia exacta aún no se ha establecido.
Otra frontera es determinar si las biopelículas bacterianas desempeñan funciones similares en otros tipos de cálculos renales. El estudio actual se centró en los cálculos a base de calcio, pero los cálculos de fosfato cálcico, los cálculos de ácido úrico y los cálculos de cistina también afectan a los pacientes. Si las bacterias son endémicas de la nefrolitiasis y no específicas del oxalato de calcio, es posible que debamos reconceptualizar la enfermedad de cálculos renales como fundamentalmente biológica y no puramente química.
El descubrimiento también resuena con hallazgos en otros campos. Las trampas extracelulares de neutrófilos (redes de ADN que las células inmunitarias liberan para atrapar patógenos) han sido implicadas recientemente en la formación de cálculos renales y biliares. ADN extracelular bacteriano, trampas extracelulares de neutrófilos: el ADN parece ser un tema recurrente en la mineralización patológica. La física es la misma ya sea que el ADN provenga de bacterias o de células humanas: los polímeros altamente cargados crean ambientes locales favorables para la nucleación de cristales.
Para los pacientes, los hallazgos son aleccionadores y potencialmente esperanzadores. Es aleccionador porque sugiere que los cálculos renales son más complejos que un simple desequilibrio químico que debe corregirse con jugo de limón y sal reducida. Esperanzador porque los procesos biológicos suelen ser más susceptibles de intervención que los puramente físicos. Se pueden atacar las bacterias, se pueden alterar las biopelículas y se puede influir en el comportamiento bacteriano.
La investigación también destaca cuánta vida persiste en lugares que pensábamos que estaban sin vida. Se estima que el 99 por ciento de las bacterias no se pueden cultivar utilizando técnicas de laboratorio estándar. Requieren nutrientes específicos, interacciones comunitarias complejas o existen en estados metabólicos estresados que los hacen viables pero no cultivables. Las bacterias que se encuentran dentro de los cálculos renales, sepultadas en cristal, protegidas por una biopelícula y que sobreviven con nutrientes mínimos, representan un extremo de persistencia microbiana. Estuvieron allí todo el tiempo. Simplemente no los estábamos buscando.
El equipo de Escocia examinó cálculos que los pacientes habían llevado durante semanas, meses y a veces años. Las biopelículas que encontraron estaban maduras, organizadas e integradas en el tejido de la piedra. En algunas muestras, las bacterias se agruparon a lo largo de los planos de escisión de los cristales, los puntos débiles naturales de la estructura mineral. En otros, llenaron los vacíos dejados por el crecimiento policristalino de la piedra. Cada piedra contaba una historia de minerales y microbios que coevolucionaban, capa por capa.
El modelo convencional de formación de cálculos renales postula que los cálculos comienzan cuando los cristales se nuclean en la orina sobresaturada y crecen hasta que se vuelven demasiado grandes para ser eliminados con el flujo urinario. Es probable que esto todavía suceda. Pero los hallazgos de Escocia sugieren que a menudo hay otro actor en el proceso: comunidades de bacterias que gestionan su carga de calcio mediante la liberación de ADN que, sin darse cuenta, crea la plantilla perfecta para los mismos minerales que eventualmente las revestirán.
Es un patrón familiar en biología: los organismos que resuelven un problema crean otro. Las bacterias producen ADN extracelular para hacer frente a los niveles altos de calcio. El ADN atrae el calcio. El calcio precipita en forma de cristales. Los cristales atrapan las bacterias. Las bacterias atrapadas continúan produciendo ADN. Se forman más cristales. Capa tras capa, la piedra crece, un monumento a las consecuencias no deseadas.
Enlace del estudio: https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2517066123
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