El ADN retorcido aumenta los efectos CRISPR fuera del objetivo

AA finales de 2023, la FDA aprobó Casgevy para la anemia de células falciformes, su primera aprobación para un tratamiento que utilizaba la herramienta de edición del genoma de repeticiones palindrómicas interespaciadas reguladoras agrupadas (CRISPR) para inactivar específicamente un gen humano como tratamiento para una enfermedad genética. Si bien las terapias genéticas basadas en CRISPR podrían potencialmente tratar varias enfermedades genéticas, las preocupaciones sobre las ediciones en sitios no específicos han retrasado su uso terapéutico.

David Rueda, biofísico de molécula única del Imperial College de Londres, estudia la actividad fuera del objetivo de la proteína asociada a CRISPR (Cas) 9, una de las nucleasas CRISPR más estudiadas. Él y su equipo demostraron en un estudio reciente publicado en Célula molecular que las conformaciones de ADN superenrolladas negativamente aumentan los efectos de Cas9 fuera del objetivo.¹ Estos hallazgos resaltan consideraciones importantes para futuras aplicaciones de la tecnología de edición del genoma.

En realidad, es muy similar a lo que obtendrías en Star Trek. Es un rayo tractor de la vida real que nos permite capturar y manipular objetos en el espacio.
-David Rueda, Imperial College de Londres

CRISPR se basa en dos componentes principales: un ARN guía (ARNg) de 17 a 24 nucleótidos que encuentra la secuencia objetivo y la nucleasa Cas que corta en esa ubicación precisa. Normalmente, para que Cas9 se una y escinda una secuencia de ADN diana, debe haber una secuencia de motivo adyacente protoespaciador (PAM) inmediatamente aguas abajo de la diana; Esto generalmente garantiza ediciones acertadas. Aun así, el sistema no es perfecto.

En un estudio previo, Rueda y su equipo demostrado que estirar el ADN aumentaba la actividad de Cas9 fuera del objetivo.² A continuación, el equipo quiso probar estos hallazgos en un contexto fisiológico; tenían curiosidad por ver cómo el superenrollamiento negativo, o la torsión insuficiente del ADN que ocurre durante la transcripción y replicación normal, influía en la actividad CRISPR Cas9 fuera del objetivo.

El grupo utilizó pinzas ópticas de una sola molécula para sus experimentos. “En realidad, es muy similar a lo que se vería en Star Trek”, dijo Rueda. “Es un rayo tractor de la vida real que nos permite capturar y manipular objetos en el espacio”. Por superenrollamiento negativo Al utilizar una cadena lineal de ADN aislada de un bacteriófago, el equipo demostró que esta conformación aumentaba considerablemente la unión de Cas9 a sitios no objetivo.³

Matt Newton, coautor del estudio que actualmente es científico visitante en el Instituto Francis Crick, estaba emocionado de ver estos efectos. “Entonces quise ver si esto realmente cambiaría algo si estuviera apuntando al ADN genómico humano real”. él dijo.

El equipo eligió un método de detección in vitro, la circularización para informar in vitro de los efectos de escisión mediante secuenciación (CÍRCULO-seq), para sus pruebas de ADN genómico humano.⁴ Los investigadores fragmentaron y circularizaron ADN de una línea celular humana y lo trataron con Cas9 y ADN girasa para inducir un superenrollamiento negativo in vitro. La actividad de Cas9 linealizó los círculos de ADN y el equipo secuenció los fragmentos lineales, revelando las secuencias donde cortaba la enzima. El equipo demostró que el tratamiento con ADN girasa duplicaba con creces el número de sitios de escisión fuera del objetivo.

El siguiente paso fue validar sus resultados en células humanas. El equipo trató células con Cas9 y utilizó INDUCIR-sequn método que les permitió secuenciar selectivamente fragmentos con roturas de ADN de doble cadena, un sello distintivo de la escisión de Cas9.⁵ Cuando los investigadores compararon las secuencias fuera del objetivo de las secuencias INDUCE-seq con las de sus experimentos CIRCLE-seq, encontraron menos del 25 por ciento de alineación entre los resultados. Estos datos sugirieron efectos adicionales de la alteración de la estructura del ADN por otros medios celulares, como la transcripción. Al probar su hipótesis, el equipo descubrió que más del 70 por ciento de los sitios fuera del objetivo estaban asignados a regiones con alta actividad transcripcional.

“Los efectos del superenrollamiento del ADN sobre la actividad de Cas9 en todo el genoma son relativamente interesantes y novedosos”, dijo Shengdar Tsai, genetista molecular del St. Jude Children’s Research Hospital que no participó en el estudio pero que posee patentes para el desarrollo de tecnologías de secuenciación del genoma, incluido CIRCLE-seq. Está interesado en ver estudios adicionales que exploren las frecuencias de estos sitios fuera del objetivo en las células y sus efectos a través de perfiles más profundos. “Comprender la actividad de los editores en todo el genoma es una cuestión realmente importante, especialmente en lo que respecta a las aplicaciones terapéuticas”, dijo Tsai. “Realmente queremos saber qué están haciendo estos editores en los genomas de las células vivas”.

“[These findings] “Puede proporcionar un mecanismo adicional mediante el cual se reclutan cortes fuera del objetivo en las células y tal vez pueda ayudarnos a diseñar nuevos sistemas CRISPR-Cas que sean más precisos”, dijo Rueda.

Referencias

1. Newton MD, et al. El superenrollamiento negativo del ADN induce actividad fuera del objetivo de Cas9 en todo el genoma. Celda Mol. 2023;83(19):3533-3545
2. Newton MD, et al. El estiramiento del ADN induce actividad fuera del objetivo de Cas9. Estructura Nat Mol Biol. 2019;26(2019):185-192
3. Rey GA, et al. ADN superenrollado ópticamente. Proc Natl Acad Sci. 2019;116(53):26534-26539
4. Tsai SQ, et al. CIRCLE-seq: Un altamente sensible in vitro detección de nucleasa CRISPR-Cas9 en todo el genoma fuera de los objetivos. Métodos nat. 2017;14:607-614
5. Dobbs FM y col. Mapeo digital de precisión de roturas del ADN genómico endógeno e inducido por INDUCE-seq. Comuna Nacional. 2022;13:3989