¿Qué son los tintes fluorescentes?
Los tintes fluorescentes son herramientas utilizadas en la biotecnología y la medicina que ofrecen un método único para detectar y cuantificar la presencia de una molécula, célula o tejido objetivo dentro de una muestra biológica aún más compleja. Se utilizan en muchos ámbitos de la investigación y el desarrollo y, a menudo, se conjugan con otras moléculas como micro o nanoportadores para bioensayos. En un entorno clínico, se pueden utilizar para controlar la administración de fármacos a los tejidos diana o para aplicaciones de diagnóstico e imágenes precisas.
Por naturaleza, cada tinte fluorescente exhibe espectros de emisión y absorbancia únicos, resultantes del cambio en los estados de energía de los electrones cuando se excita el fluoróforo. Estos espectros de absorbancia y emisión no sólo pueden existir dentro del espectro visible, sino también en el ultravioleta (UV) y el infrarrojo cercano (NIR). Además, los tintes fluorescentes son muy sensibles, selectivos y tienen una toxicidad extremadamente baja, lo que los hace útiles para aplicaciones in vivo, in vitro e in situ.
Detección fluorescente en comparación con otros métodos
Además de la fluorescencia, la colorimetría es otro método para detectar compuestos o células diana dentro de una muestra. En los ensayos colorimétricos, el sustrato o actividad objetivo a menudo produce un subproducto coloreado, que es cuantificable mediante espectroscopia de absorbancia y que está directamente relacionado con la presencia y/o concentración del objetivo dentro de la muestra.
Una aplicación de los ensayos colorimétricos es evaluar la viabilidad celular total dentro de una muestra. Por ejemplo, en el ensayo de exclusión de azul tripán, las células que han perdido la integridad de la membrana aparecerán azules debido a la unión de azul tripán a macromoléculas y proteínas intracelulares, destacando las células no viables. El CCK-8 (kit de recuento de células-8) es otro ensayo de viabilidad celular; se basa en la reducción de una sal de tetrazolio, WST-8, por la deshidrogenasa para producir un tinte de formazán de color amarillo. Dado que están involucradas deshidrogenasas activas, se correlaciona con células viables. En una línea similar, el MTT El ensayo también se puede utilizar para determinar indirectamente la viabilidad celular mediante la evaluación del metabolismo celular. Este ensayo se basa en la oxidorreductasa de NADH en las células para cuantificar la actividad metabólica total dentro de una población celular.
Otro uso común de los ensayos colorimétricos incluye la cuantificación de proteínas totales. Por ejemplo, el ensayo BCA es aquel que combina la reducción de Cu2+ a Cu1+ por proteínas en medio alcalino, con la detección del catión cuproso por el ácido bicinconínico (BCA). Un segundo ensayo relacionado es el ensayo de Bradfordque se basa en la reacción entre el azul de Coomassie acidificado y las proteínas para sufrir un cambio de color cuantificable.
Aunque se pueden utilizar ensayos colorimétricos y fluorométricos para fines similares, los mecanismos por los cuales funcionan estos ensayos no son los mismos. En un ensayo colorimétrico, la concentración de un compuesto objetivo se determina en función de la absorbancia de un sustrato coloreado. En los ensayos fluorométricos, por otro lado, la concentración de un objetivo está determinada por la actividad cinética de la luz absorbida y emitida por una reacción, no por un color. De manera similar para ambos ensayos, la cuantificación del color (colorimétrico) o de la luz (fluorométrico) es directamente proporcional a la cantidad del compuesto objetivo presente.
Si bien ambas técnicas tienen sus propias consideraciones, los ensayos basados en fluorescencia tienen una serie de beneficios en comparación con los métodos colorimétricos. Los tintes fluorescentes se pueden utilizar en muestras fijadas y permeabilizadas, así como en células vivas. Esto significa que una población de células se puede estudiar mejor ya que estaría en un estado activo natural, por ejemplo, en imágenes fluorescentes de por vida (FLIM). La detección fluorescente es más sensible que los medios colorimétricos y puede usarse para un rango más amplio de concentración de analitos. Este atributo es particularmente útil cuando una molécula o célula objetivo es especialmente rara o escasa dentro de la solución. En condiciones optimizadas, los tintes fluorescentes son cada vez más estables, aunque los efectos del fotoblanqueo nunca pueden anularse por completo. Los resultados de los ensayos de fluorescencia también se pueden interpretar con muchos tipos diferentes de equipos, incluidos microscopía de fluorescencia, citometría de flujo, espectrómetro y lectores de microarrays.
También cabe mencionar que los ensayos de detección fluorescente, en muchos casos, pueden ser más adecuados para un experimento particular que los ensayos quimioluminiscentes. Por ejemplo, existen ensayos de viabilidad celular que se basan en la luciferasa/D-luciferina sistema para cuantificar el ATP como una métrica de la salud celular. Si bien son sensibles, debido a su fondo muy bajo, estos ensayos son difíciles de multiplexar para medir una variedad de factores celulares simultáneamente.
Tinciones y ensayos fluorométricos comunes
Se han utilizado varios tintes fluorescentes como herramienta para evaluar la viabilidad celular. Un tinte común, yoduro de propidio (PI), es una contratinción nuclear y cromosómica de color rojo fluorescente que se une al ADN. No es permeable a las células y se utiliza para evaluar las células muertas en una población. Otro tinte, calceína AM (acetometoxi), tiene propiedades lipófilas que lo hacen permeable a las células. La calceína AM exhibe un color verde brillante al unirse a iones de calcio libres intracelulares, y la solubilidad de este éster de AM puede mejorarse mediante Plurónico F-127. Estos dos tintes a menudo se combinan en un solo kit, como un ensayo de vivo/muerto, para usarse en conjunto para indicar células vivas, células muertas y/o ADN. Dependiendo de la etiqueta fluorescente utilizada, ensayos vivos/muertos funcionan a través de la integridad de la membrana de una célula, actividad esterasa, actividad metabólica o segmentación estructural de una proteína o péptido.
Los tintes y ensayos fluorescentes también pueden estar orientados a detectar y/o cuantificar ácidos nucleicos dentro de una muestra. Por ejemplo, el 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) se une fuertemente a regiones del ADN ricas en adenina-timina (AT). DAPI Se utiliza a menudo para cuantificar el ADN o como contratinción nuclear para marcar células que han perdido la integridad de la membrana. En 5′-bromo-2′-desoxiuridina (BrdU) ensayos, las tasas de proliferación celular se evalúan detectando la tasa de síntesis de ADN o ARN. Esta técnica se realiza mediante el uso de un tinte fluorescente y un anticuerpo anti-BrdU. Alternativamente, naranja de acridina es un tinte permeable a las células que emite verde cuando se une a dsDNA y rojo cuando se une a ssDNA o RNA. También se usa comúnmente en estudios del ciclo celular y puede usarse para la detección lisosomal. 7-aminoactinomicina D (7-DAA), también muestra una fuerte afinidad por el dsDNA, particularmente por las regiones ricas en guanina-citosina (GC), y se utiliza en muchos estudios de bandas cromosómicas.
También se pueden utilizar tintes fluorescentes para detectar la apoptosis y para estudios de citotoxicidad. Anexina V pertenece a una familia de proteínas fijadoras de fosfolípidos dependientes de calcio y tiene una alta afinidad por la fosfatidilserina. Puede detectar cambios apoptóticos en etapa temprana, generalmente en combinación con un tinte de viabilidad (p. ej., 7-AAD o PI). Cuando se conjuga con isotiocianato de fluoresceína (FITC), este tinte marca los sitios de fosfatidilserina en las superficies de las membranas y se utiliza para evaluar la apoptosis activa. Manchas de Hoeschst, como Hoeschst 33342son tinciones permeables a la membrana celular que se unen al surco menor del ADNbc y a menudo se utilizan como contratinción nuclear para estudios del ciclo celular. Las tinciones de Hoeschst tiñen la cromatina condensada en células apoptóticas más brillante que la cromatina en células viables.
Quizás uno de los usos más extendidos de los tintes fluorescentes sea la caracterización de proteínas, incluidos estudios que se centran en la caracterización, agregación, señalización intracelular, estructura o incluso unión. Tintes de cianina, incluidos cy7, cy5, Cy5.5 y Cy3vienen en formas de éster NHS reactivo, que permiten la unión a grupos amina libres en proteínas y anticuerpos. Estos tintes varían desde naranja hasta NIR en fluorescencia. Otro ejemplo es ficoeritrina (PE), una proteína de la familia de las ficobiliproteínas, presente en cianobacterias y algas rojas. Se utiliza para marcar anticuerpos y receptores celulares en microscopía, ensayos de inmunidad y basados en ADN. Un tercer tinte popular es la 5-carboxifluoresceína (5-FAM), que exhibe una fluorescencia verde y se usa más comúnmente para in situ Marcado de péptidos, proteínas y nucleótidos. Algunos tintes fluorescentes tienen funciones aún más especializadas, por ejemplo, tioflavina T es un colorante de benzotiazol permeable a las células que se une a las fibrillas de amiloide y se utiliza para monitorear agregados de láminas β apiladas. Asimismo faloidina Las tinciones se utilizan más para cuantificar la actina F y pueden conjugarse con tintes fluorescentes fotoestables brillantes en muestras fijadas y/o permeabilizadas.
Los tintes fluorescentes también se pueden utilizar para aplicaciones más específicas, como la señalización del calcio. Por ejemplo, fluo-4 exhibe fluorescencia al unirse a Ca2+. Se utiliza para obtener imágenes de la dinámica espacial del Ca2+, determinar mensajeros secundarios, en estudios de neurotransmisores y en exámenes farmacológicos basados en células. Otro tinte fluorescente, el JC-1 colorante, es un compuesto de carbocianina catiónico que ingresa y se acumula en las mitocondrias. En concentraciones bajas, que indican un potencial de membrana bajo, el tinte presenta fluorescencia verde, mientras que en concentraciones más altas y, por lo tanto, con un potencial más alto, el tinte aparece rojo. Cualquiera sea el caso, es fácil ver que los usos de los tintes fluorescentes son extensos. Es importante destacar que los colorantes a menudo no son específicos de un solo tipo de ensayo. Por ejemplo, el mismo tinte que puede detectar y cuantificar el ADNbc también puede ser perfecto para evaluar la viabilidad celular según los objetivos y objetivos de un experimento. Los tintes y ensayos fluorescentes mencionados aquí simplemente raspan la superficie de aquellos que se han utilizado en la literatura.
Conclusiones clave sobre los tintes fluorescentes
El uso de tintes fluorescentes a lo largo de la investigación y el desarrollo es muy versátil. La naturaleza multifacética de las sondas fluorescentes se debe en parte a su amplia disponibilidad comercial y su catálogo diverso. Además, los protocolos basados en fluorescentes requieren muy pocos pasos prácticos, lo que limita el potencial de contaminación. Pueden usarse en un ensayo independiente o incorporarse a un experimento junto con otros métodos de detección. Estos atributos hacen de los tintes fluorescentes una adición útil y práctica a muchos esfuerzos científicos.