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METROLa mayoría de las personas se preguntan cómo cambiarían sus vidas si pudieran retroceder en el tiempo y rehacer decisiones pasadas. Si bien es una hazaña aparentemente imposible, los biólogos de células madre Kazutoshi Takahashi y Shinya Yamanaka en la Universidad de Kyoto por primera vez dieron marcha atrás a la reloj celular en 2006.1 Al sobreexpresar cuatro factores de transcripción en fibroblastos completamente diferenciados, Takahashi y Yamanaka reprogramaron las células a un estado pluripotente y las llamaron células madre pluripotentes inducidas (iPSC).

Aunque los investigadores emplear iPSC En el laboratorio y la clínica, los científicos luchan por producir de manera eficiente grandes cantidades de iPSC.2 «La reprogramación sigue siendo muy ineficiente», dijo Thorsten Schläger, biólogo de células madre del Hospital Infantil de Boston. «Todavía no se comprende completamente por qué el 98 o el 99,9 por ciento de las células no terminan reprogramándose en iPSC». En un artículo publicado recientemente Avances científicos En el artículo, Schlaeger y su equipo desarrollaron un sistema para rastrear el destino de las células con diferentes dinámicas de expresión de factores de transcripción durante la reprogramación.3 Estos hallazgos permitirán a los investigadores en el campo mejorar el rendimiento de las iPSC.

Los científicos sospecharon que la heterogeneidad en los resultados de la reprogramación se debe a variaciones en los niveles y duraciones de la expresión de los factores de transcripción. En consecuencia, varios grupos de investigación han intentado correlacionar el éxito de la reprogramación con los niveles del factor de transcripción de unión al octámero 4 (OCT4), que es uno de los factores de transcripción de Takahashi y Yamanaka esencial para el proceso de reprogramación. Sin embargo, estos estudios utilizaron mediciones basadas en la población y no consideraron la contribución del OCT4 endógeno a la reprogramación.

Obligado a superar estas limitaciones, el coautor de Schlaeger Domitilla Del Vecchio, un ingeniero mecánico del Instituto de Tecnología de Massachusetts, desarrolló un innovador sistema de expresión OCT4. «La idea realmente era intentar utilizar una forma más sofisticada de sobreexpresar factores de transcripción para reprogramar las células madre», recordó Del Vecchio.

El equipo de Del Vecchio diseñó un circuito genético sintético para sobreexpresar ectópicamente una versión marcada fluorescentemente del factor de transcripción OCT4, al tiempo que bloquea la expresión del OCT4 endógeno a través de microARN. Esto permitió a los investigadores controlar los niveles totales de proteína OCT4 dentro de la célula y cuantificarlos midiendo la fluorescencia. Además, el ectópico OCT4 El gen estaba controlado por un promotor inducible y ruidoso, lo que significaba que el sistema generaba variabilidad en la expresión del conjugado OCT4 y una amplia gama de trayectorias para evaluar, como células que mantuvieron una alta expresión de OCT4 durante la reprogramación o aquellas cuya expresión disminuyó con el tiempo. .

Thorsten Schlaeger y Domitilla Del Vecchio desarrollaron un sistema basado en un circuito de genes sintéticos que les permitió controlar y monitorear los niveles totales de proteína OCT4 dentro de los fibroblastos durante la reprogramación.

Thorsten Schlaeger y Domitilla Del Vecchio

Para determinar qué trayectorias de OCT4 reprogramaron con éxito los fibroblastos dérmicos humanos en iPSC, Del Vecchio, Schlaeger y su equipo transdujeron las células con vectores lentivirales que codificaban su generador de trayectoria OCT4 y siguieron los niveles de proteínas OCT4 marcadas con fluorescencia dentro de las células a lo largo del tiempo a través de imágenes. Luego, los investigadores fijaron las colonias de células resultantes y las inmunotiñeron para detectar dos marcadores de superficie de células madre pluripotentes.

Observaron que las colonias se clasificaban en tres categorías: las colonias de tipo I eran positivas sólo para uno de los marcadores de superficie; las colonias de tipo II mostraron el patrón de tinción exactamente opuesto al del tipo I; y las colonias tipo III fueron positivas para ambos marcadores. Consideraron las células dentro de las colonias de tipo III como iPSC y clasificaron las células dentro de las colonias de tipo I y II como reprogramadas de manera incompleta. A pesar de estas diferencias, las células en los tres tipos de colonias expresaron de manera estable niveles suprafisiológicos de OCT4 durante la reprogramación, lo que indica que la reprogramación exitosa de fibroblastos dérmicos humanos en iPSC requiere niveles consistentemente altos del factor de transcripción OCT4. Pero este parámetro por sí solo no es suficiente para promover la generación de iPSC.

“El documento es innovador en el sentido técnico. Es consistente con el trabajo que se ha realizado que muestra que los niveles elevados de OCT4 son importantes para el proceso de reprogramación”, dijo Dean Tantíngenetista de la Universidad de Utah, que no participó en el estudio.

Aunque Tantin pensó que el sistema de Del Vecchio presentaba una forma inteligente de examinar directamente los niveles totales de proteína OCT4 dentro de las células vivas, sugirió que examinar los niveles de proteína por sí solo puede no transmitir toda la historia. “El nivel de una proteína basado en un marcador fluorescente no es lo mismo que la actividad de una proteína: su capacidad para unirse al ADN. [or] su capacidad para regular la transcripción una vez que se une», señaló. «Entonces, creo que hacia dónde debe ir el campo ahora es [to find out] cómo la actividad de OCT4 se regula realmente dinámicamente durante [reprogramming].” El lo notó. Basándose en esta idea, Tantin y su equipo determinaron recientemente que la actividad de OCT4 durante la reprogramación y la diferenciación es regulado por redoxy sospecha que la regulación de otros componentes de la reprogramación será de interés en los próximos años.4

Del Vecchio espera que su trabajo inspire a otros investigadores a pensar más allá de los métodos estándar que emplean para diseccionar vías moleculares. «Este estudio muestra cómo se pueden utilizar herramientas de ingeniería genética más sofisticadas en el contexto de un proceso biológico altamente complejo y ayudar a obtener información que sería difícil de obtener de otra manera», dijo Del Vecchio.

Schlaeger quiere aprovechar el conocimiento adquirido en este estudio para desarrollar terapias disponibles basadas en iPSC, como las células CAR T, y cree que la ingeniería de precisión será la clave para llevar estos productos a la clínica de forma segura. «Con las células, queremos llegar a este control preciso y eso sólo se puede lograr con interruptores y circuitos genéticos complejos», dijo Schlaeger.

Referencias

  1. Takahashi K, Yamanaka S. Inducción de células madre pluripotentes a partir de cultivos de fibroblastos adultos y embrionarios de ratón mediante factores definidos. Celúla. 2006;126(4):663-676.
  2. Shi Y, et al. Tecnología de células madre pluripotentes inducidas: una década de progreso. Descubrimiento de medicamentos de Rev Nat. 2017;16(2):115-130.
  3. Ilia K, et al. Circuitos genéticos sintéticos para descubrir las trayectorias de OCT4 de reprogramación exitosa de fibroblastos humanos. Ciencia avanzada. 2023;9(48):eadg8495.
  4. Shen Z, et al. La sensibilidad redox del 4 de octubre potencia la reprogramación y la diferenciación. Preimpresión. bioRxiv. 2023:2023.02.21.529404.